潰瘍性結(jié)腸炎患者ABCB1基因表達及腸道菌群變化的研究.pdf

1、背景：
　　潰瘍性結(jié)腸炎是臨床消化內(nèi)科常見疾病，發(fā)病率有逐年升高趨勢，其嚴重降低患者生活質(zhì)量并增加醫(yī)療負擔。潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)病可能與遺傳、飲食過敏、感染、自身免疫、精神抑郁及焦慮等因素有關。既往研究提示ABCB1基因敲除小鼠有21％自發(fā)結(jié)腸炎，而對照組小鼠無1例發(fā)生結(jié)腸炎，這種發(fā)生在ABCB1基因敲除小鼠的結(jié)腸炎與人類潰結(jié)的發(fā)病及病理改變很相似;在藥物誘導的潰結(jié)小鼠模型研究中發(fā)現(xiàn)ABCB1基因在結(jié)腸黏膜上皮細胞的表達及活性下調(diào)。上

2、述動物實驗提示潰結(jié)的易感性與ABCB1基因的功能有關，但這一結(jié)論仍存在爭議。本文旨在通過實驗研究探討人類ABCB1基因表達水平與潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)病的關系。
　　編碼P-糖蛋白的人類ABCB1基因包含28個內(nèi)含子，其中26個內(nèi)含子阻斷P-糖蛋白的線性表達，位于7號染色體長臂7q21.1位點上;ABCB1基因表達的mRNA長度為4.7kDa，其中編碼區(qū)還占不到整條ABCB1基因mRNA核酸鏈長度的5％。有研究發(fā)現(xiàn)ABCB1基因與炎癥性腸

3、病的易感性有關。P-糖蛋白(P-glycoprotein，Pgp)是人類多藥耐藥基因(MDR1)的編碼產(chǎn)物，是ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運載體蛋白家族(adenosine triphosphate-binding cassette family)中的最大的一個亞系，編碼Pgp的基因被稱為ABCB1基因(ATP-binding cassette，subfamily B)。人類的Pgp是一種ATP依賴性跨膜轉(zhuǎn)運蛋白，可將細胞內(nèi)的藥物、毒物、代謝廢物等跨

4、膜轉(zhuǎn)運到細胞外。Pgp在細胞膜的脂質(zhì)雙分子層可與藥物分子結(jié)合并發(fā)生相互作用，然后在ATP的水解功能作用下將藥物逆濃度梯度跨膜轉(zhuǎn)運。親脂性和兩性分子通常是Pgp的作用底物;Pgp可在血腦屏障、睪丸毛細血管上皮細胞、肝細胞表面、腎上腺、大腸及小腸黏膜上皮細胞的刷狀緣、外周血單核細胞、NK細胞、T淋巴細胞和B淋巴細胞等多個人體正常組織表達。Pgp與正常組織細胞的分泌功能密切相關，跨膜轉(zhuǎn)運功能可減少毒素從腸道吸收，并將胞內(nèi)的內(nèi)源性和外源性毒素通

5、過向膽汁、尿液和腸腔分泌的方式排出體外，從而阻止了毒素在重要臟器的積聚，因此，Pgp構(gòu)成了人體腸道、泌尿道、膽道的保護性屏障。在正常人體的胃腸道，Pgp在結(jié)腸和遠端小腸柱狀上皮細胞富集[8];Pgp在胃腸道的功能是減少內(nèi)源性和外源性毒素的吸收。肝臟、肺臟、腸道和腎臟是體內(nèi)最容易暴露于毒性物質(zhì)的部位，而ABCB1基因表達的Pgp在上述這四個部位（器官）富集程度最高;Pgp是保護人體正常細胞免受毒物損害的重要機制之一。人為給予敲除ABCB1

6、基因的小鼠在SPF飼養(yǎng)環(huán)境下可自發(fā)結(jié)腸炎，而抗生素的使用可阻斷或逆轉(zhuǎn)這種結(jié)腸炎的發(fā)生;所以，腸道菌群是始動并維持腸道炎癥反應的必要因素;而外源性毒素排出機制喪失會促進結(jié)腸炎癥的發(fā)生。
　　腸道微生態(tài)在炎癥性腸病發(fā)生發(fā)展過程中可能發(fā)揮作用。已有研究結(jié)果提示，炎癥性腸病患者較健康人群腸道菌群多樣性顯著受損，部分益生菌減少，部分“致病菌”增加。但目前對潰瘍性結(jié)腸炎患者腸道各菌種變化情況的研究結(jié)果差異較大，因此有必要對潰瘍性結(jié)腸炎患者腸道

7、微生態(tài)改變進一步研究。
　　此外，關于腸道Pgp表達與潰瘍性結(jié)腸炎患者腸道菌群改變相關性的研究尚未見報道，本研究將針對這一問題進行初步研究。
　　目的：
　　通過本研究闡明潰瘍性結(jié)腸炎患者在治療前后較健康對照者腸粘膜ABCB1基因表達水平的變化及其對腸黏膜屏障功能的影響，為尋找潰瘍性結(jié)腸炎病因提供實驗理論依據(jù)。通過檢測潰瘍性結(jié)腸炎和健康對照者腸道細菌16SrRNA表達水平的變化，分析潰瘍性結(jié)腸炎患者腸道微生物菌群構(gòu)成變

8、化。分析出腸黏膜P糖蛋白表達水平對腸道菌群變化的影響，探究ABCB1基因與腸道微生態(tài)變化的關系。
　　方法：
　　1.通過免疫組織化學染色，實時熒光定量PCR，Western blot等方法檢測潰瘍性結(jié)腸炎患者腸黏膜ABCB1基因表達水平的變化;潰瘍性結(jié)腸炎患者治療前后分別與健康對照者進行比較。
　　2.檢測潰瘍性結(jié)腸炎患者及健康對照者血內(nèi)毒素及D-乳酸水平變化，并分析ABCB1基因表達水平與血內(nèi)毒素及D-乳酸水平變化

9、的相關性，分析ABCB1基因表達水平變化與腸黏膜屏障功能改變的關系。
　　3.通過檢測潰瘍性結(jié)腸炎患者及健康對照者糞便擬桿菌，雙歧桿菌，乳酸桿菌，纏繞桿菌，腸球菌，梭狀芽孢桿菌，脆弱桿菌菌群菌量變化情況，分析潰瘍性結(jié)腸炎患者腸道微生態(tài)變化情況。通過檢測糞便細菌16SrRNA完成上述實驗。
　　4.通過分析P糖蛋白表達陰性及表達陽性的健康對照者腸道擬桿菌，雙歧桿菌，乳酸桿菌，纏繞桿菌，腸球菌，梭狀芽孢桿菌，脆弱桿菌等七種菌群的

10、差異，初步分析P糖蛋白表達情況對腸道微生物構(gòu)成的影響。
　　5.通過分析P糖蛋白表達陰性及表達陽性的潰瘍性結(jié)腸炎患者腸道擬桿菌，雙歧桿菌，乳酸桿菌，纏繞桿菌，腸球菌，梭狀芽孢桿菌，脆弱桿菌等七種菌群的差異，初步分析P糖蛋白表達情況對潰瘍性結(jié)腸炎患者腸道微生態(tài)變化的影響。
　　結(jié)果：
　　1.免疫組織化學染色結(jié)果顯示，潰瘍性結(jié)腸炎患者腸黏膜P糖蛋白(ABCB1基因產(chǎn)物)表達陽性率顯著低于健康對照者;潰瘍性結(jié)腸炎患者治療后

11、腸黏膜P糖蛋白表達水平顯著高于治療前水平，但仍低于健康對照組。
　　2.實時熒光定量PCR及Western Blot實驗結(jié)果顯示，潰瘍性結(jié)腸炎患者腸黏膜ABCB1基因表達水平（mRNA及蛋白水平）均顯著低于健康對照者;潰瘍性結(jié)腸炎患者治療后腸黏膜ABCB1基因表達水平(mRNA及蛋白水平)顯著高于治療前水平，但仍低于健康對照組;
　　3.潰瘍性結(jié)腸炎患者血內(nèi)毒素及D-乳酸水平顯著高于健康對照組，潰瘍性結(jié)腸炎患者治療后內(nèi)毒素及

12、D-乳酸水平較治療前下降，但仍高于健康對照者，提示潰瘍性結(jié)腸炎患者腸黏膜屏障功能受損。潰瘍性結(jié)腸炎患者腸黏膜P糖蛋白表達水平與血內(nèi)毒素及D-乳酸水平呈負相關。
　　4.初治潰瘍性結(jié)腸炎患者糞便擬桿菌菌量較健康對照者顯著下降，差異有統(tǒng)計學意義;糞便雙歧桿菌菌量在潰瘍性結(jié)腸炎患者顯著低于健康對照者;潰瘍性結(jié)腸炎患者糞便乳酸桿菌菌量顯著低于健康對照者;潰瘍性結(jié)腸炎患者糞便纏繞桿菌菌量顯著低于健康對照者，差異有統(tǒng)計學意義;潰瘍性結(jié)腸炎患者

13、糞便腸球菌菌量顯著低于健康對照者，有統(tǒng)計學差異;然而，潰瘍性結(jié)腸炎患者腸道梭狀芽孢桿菌菌量較健康對照組顯著升高，有統(tǒng)計學意義;潰瘍性結(jié)腸炎患者糞便脆弱桿菌菌量較健康對照組顯著下降，有統(tǒng)計學差異。
　　5.Pgp表達陽性的健康對照者較陰性者有如下變化，糞便擬桿菌菌量升高，有統(tǒng)計學差異;糞便雙歧桿菌菌量升高，有統(tǒng)計學差異;糞便乳酸桿菌菌量升高，有統(tǒng)計學差異;糞便纏繞桿菌菌量升高，沒有統(tǒng)計學意義;糞便腸球菌菌量升高，有統(tǒng)計學差異;而腸道

14、梭狀芽孢桿菌菌量下降，有統(tǒng)計學差異;糞便脆弱桿菌菌量升高，有統(tǒng)計學差異。
　　6.Pgp表達陽性的潰瘍性結(jié)腸炎患者較陰性者有如下變化:糞便擬桿菌菌量升高，差異有統(tǒng)計學意義;糞便雙歧桿菌菌量升高，差異有統(tǒng)計學意義;糞便乳酸桿菌菌量升高，差異有統(tǒng)計學意義;糞便纏繞桿菌菌量升高，差異有統(tǒng)計學意義;糞便腸球菌菌量升高，差異有統(tǒng)計學意義;而腸道梭狀芽孢桿菌菌量下降，差異有統(tǒng)計學意義;糞便脆弱桿菌菌量升高，差異有統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)論：

15、
　　我們的研究結(jié)果顯示雙歧桿菌，腸球菌，梭狀芽孢桿菌，擬桿菌，脆弱桿菌，乳酸桿菌，纏繞桿菌等七種主要菌群均在潰瘍性結(jié)腸炎患者中發(fā)生了顯著變化，并且此類變化與P糖蛋白表達水平相關。結(jié)合既往研究結(jié)果，提示腸道微生態(tài)變化可能參與潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)生發(fā)展過程。總體研究結(jié)果表明，潰瘍性結(jié)腸炎患者腸道微生物多樣性受損，致病菌群相對增多，益生菌及正常菌群相對減少。
　　本研究中初診潰瘍性結(jié)腸炎患者腸粘膜炎癥部位的ABCB1基因表達是下調(diào)的

16、，無論從轉(zhuǎn)錄的mRNA水平還是表達的蛋白水平方面。潰瘍性結(jié)腸炎患者P糖蛋白表達水平低下，導致腸粘膜屏障受損、通透性增加，誘發(fā)腸粘膜炎癥反應，因此P糖蛋白低表達是潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)病的原因之一，在潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)病過程中，P糖蛋白可能扮演了一個重要的角色。經(jīng)過潑尼松治療后，潰瘍性結(jié)腸炎患者腸粘膜P糖蛋白表達上調(diào)，腸粘膜屏障功能改善，部分患者臨床癥狀緩解。所以潰瘍性結(jié)腸炎患者出現(xiàn)P糖蛋白高表達是應用激素后誘發(fā)的反應，不是患者自發(fā)的現(xiàn)象。通過本研