高定植肝癌細(xì)胞株中差異表達(dá)基因SLC38A4、GJA1在肝癌肝內(nèi)轉(zhuǎn)移過(guò)程中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、原發(fā)性肝細(xì)胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)，作為肝癌惡性腫瘤的一類，是中國(guó)發(fā)生率高且危害極大的惡性腫瘤之一。研究表明，肝內(nèi)轉(zhuǎn)移是肝癌的首要轉(zhuǎn)移位點(diǎn)，也是肝癌致死的首要原因。目前對(duì)肝癌細(xì)胞的肝內(nèi)轉(zhuǎn)移過(guò)程雖有所了解，但是研究尚不深入，尚無(wú)有效治療靶點(diǎn)和藥物阻斷肝癌肝內(nèi)轉(zhuǎn)移過(guò)程。因此需要進(jìn)一步明確肝癌細(xì)胞肝內(nèi)轉(zhuǎn)移過(guò)程中的關(guān)鍵分子及其作用機(jī)制。
　　除了自身抑癌或促癌基因的改變外，細(xì)胞與他們賴以生存的微環(huán)境

2、之間的相互作用對(duì)于正常組織內(nèi)穩(wěn)態(tài)以及腫瘤組織的生長(zhǎng)都是至關(guān)重要的。特別是腫瘤細(xì)胞與相關(guān)間質(zhì)之間的相互作用形成了一個(gè)強(qiáng)大的關(guān)系網(wǎng)，可影響腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展和預(yù)后。腫瘤的轉(zhuǎn)移是一個(gè)復(fù)雜的、多步驟、多因素參與的過(guò)程，包括原發(fā)腫瘤的形成、原發(fā)灶腫瘤細(xì)胞的局部侵襲，腫瘤細(xì)胞內(nèi)滲入血管和淋巴管，在血管和淋巴管中的生存，外滲出血管和淋巴管，在遠(yuǎn)端定植灶的存活。腫瘤轉(zhuǎn)移過(guò)程中，腫瘤的微環(huán)境發(fā)揮了重要的作用，其中包括腫瘤低氧環(huán)境、腫瘤相關(guān)的巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞

3、、NK細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞、腫瘤相關(guān)的成纖維細(xì)胞以及內(nèi)皮細(xì)胞等。任何腫瘤轉(zhuǎn)移的最終結(jié)局都是在遠(yuǎn)端定植灶上形成新的腫瘤，腫瘤是如何在遠(yuǎn)端定植灶的存活和再生這個(gè)問(wèn)題一直是科學(xué)家想攻克的難題。為了研究腫瘤轉(zhuǎn)移過(guò)程的最終階段-在遠(yuǎn)端定植灶的存活，篩選出能夠高定植的細(xì)胞顯得尤為重要。
　　為了研究肝癌轉(zhuǎn)移過(guò)程的最終階段-在遠(yuǎn)端定植灶的存活，構(gòu)建了脾臟注射-肝定植（轉(zhuǎn)移）模型，利用該模型篩選獲得了一系列的高定植（轉(zhuǎn)移）能力的肝癌細(xì)胞株。利用表達(dá)譜

4、芯片檢測(cè)，根據(jù)P值＜0.05，差異倍數(shù)≥5倍，篩選到64條在高定植細(xì)胞中差異表達(dá)的mRNA。進(jìn)一步在更多的高定植細(xì)胞中驗(yàn)證，以確保在除了芯片中的兩株細(xì)胞以外至少還有另外兩株高定植細(xì)胞表達(dá)符合差異基因的表達(dá)結(jié)果，以此篩選到31條基因，其中上調(diào)表達(dá)基因17條、下調(diào)表達(dá)基因14條。根據(jù)與肝癌臨床病人預(yù)后之間的關(guān)系，最終篩選到SLC38A4、GJA1在高定植細(xì)胞株中普遍存在差異表達(dá)，在多個(gè)隊(duì)列的肝癌組織樣本中也存在差異表達(dá)，并且與肝癌病人的高復(fù)

5、發(fā)率、差的預(yù)后相關(guān)。
　　發(fā)現(xiàn)SLC38A4不僅在肝癌組織樣本中下調(diào)表達(dá)并且隨著肝癌的進(jìn)展表達(dá)量逐漸降低，在肝臟發(fā)育過(guò)程中還呈現(xiàn)逐漸上調(diào)表達(dá)的趨勢(shì)，且與肝癌病人的預(yù)后呈正相關(guān)，即肝癌病人SLC38A4含量越高，病人的預(yù)后情況越好。又對(duì)SLC38A4的臨床預(yù)后進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)SLC38A4的表達(dá)情況與肝癌病人的腫瘤大小、TNM分期、BCLC分期、腫瘤轉(zhuǎn)移以及血清AFP含量相關(guān)。隨后進(jìn)行了SLC38A4的生物學(xué)功能研究，干性球形成實(shí)驗(yàn)證

6、實(shí)干擾SLC38A4增強(qiáng)肝癌細(xì)胞的干性能力;CCK8、乙炔脫氧尿甘結(jié)合染色(EDU)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)以及細(xì)胞周期檢測(cè)證實(shí)干擾SLC38A4促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖;劃痕實(shí)驗(yàn)以及transwell實(shí)驗(yàn)證實(shí)干擾SLC38A4可以促進(jìn)肝癌細(xì)胞的遷移、侵襲;裸鼠體內(nèi)皮下荷瘤實(shí)驗(yàn)證實(shí)干擾SLC38A4促進(jìn)腫瘤的增殖。上述結(jié)果證明SLC38A4為抑癌基因，干擾SLC38A4在體內(nèi)體外條件下都可以促進(jìn)肝癌的進(jìn)展。Western blot結(jié)果顯示干擾SLC38A4

7、可以增加ERK和AKT磷酸化水平，表明干擾SLC38A4可以使腫瘤中的MAPK信號(hào)通路及PI3K/AKT信號(hào)通路活化，促進(jìn)肝癌的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移。
　　對(duì)GJA1進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)GJA1在高定植細(xì)胞中普遍高表達(dá)，在多個(gè)隊(duì)列的肝癌組織中也是高表達(dá)，并且與肝癌病人的高復(fù)發(fā)率、差的預(yù)后呈正相關(guān)。裸鼠脾臟注射-肝定植體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，GJA1能夠增強(qiáng)肝癌細(xì)胞的肝內(nèi)定植能力。對(duì)過(guò)表達(dá)GJA1的細(xì)胞進(jìn)行了體外功能學(xué)實(shí)驗(yàn)，CCK8、克隆形成、EDU檢測(cè)細(xì)

8、胞增殖能力，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期變化，transwell實(shí)驗(yàn)以及細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移侵襲能力，發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)GJA1對(duì)細(xì)胞本身的增殖能力、遷移侵襲能力沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的影響。為了探究高定植肝癌細(xì)胞株高定植的原因，對(duì)高定植肝癌細(xì)胞株進(jìn)行裸鼠皮下荷瘤，發(fā)現(xiàn)體內(nèi)情況下高定植細(xì)胞株所形成的腫瘤增殖更快，有更強(qiáng)的血管形成能力。將過(guò)表達(dá)GJA1的細(xì)胞進(jìn)行裸鼠皮下荷瘤，CD31、CD34染色顯示過(guò)表達(dá)GJA1細(xì)胞形成的皮下荷瘤有更高的血管密度。為了探

9、究GJA1對(duì)血管形成的影響，用過(guò)表達(dá)GJA1細(xì)胞及對(duì)照組細(xì)胞的條件培養(yǎng)基刺激臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)發(fā)現(xiàn)小管形成并無(wú)差異性改變。由于GJA1可以使兩種細(xì)胞之間形成縫隙連接(gap junction)，使其相互之間傳遞物質(zhì)，猜測(cè)過(guò)表達(dá)GJA1的細(xì)胞可能和HUVEC通過(guò)直接接觸后形成縫隙連接促進(jìn)小管的形成，于是將過(guò)表達(dá)GJA1及對(duì)照的肝癌細(xì)胞與HUVEC進(jìn)行共培養(yǎng)，檢測(cè)到過(guò)表達(dá)GJA1細(xì)胞相對(duì)于對(duì)照細(xì)胞與HUVEC共培養(yǎng)后形成小管能力增