番茄灰霉病拮抗菌株的選育、基因改造及其發(fā)酵液大棚試驗(yàn)研究.pdf

1、本研究首先針對(duì)樣品進(jìn)行了拮抗菌株的初篩和復(fù)篩。然后在此基礎(chǔ)上對(duì)高效廣譜拮抗菌進(jìn)行了菌株的初步鑒定、菌株的基因改造、菌株發(fā)酵條件的優(yōu)化、菌株發(fā)酵液大棚防病效果這幾個(gè)方面的研究。
　　 采用樣品稀釋法進(jìn)行拮抗菌株的分離，共獲得了31株拮抗菌株。其中的一株廣譜拮抗菌D2菌株，其對(duì)番茄灰霉病的抑制效果尤其明顯。通過(guò)形態(tài)觀察和生理生化實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了菌株的初步鑒定，菌株D2為芽孢桿菌屬。
　　 從質(zhì)粒pUC1965中得到了含有幾丁質(zhì)酶基

2、因的6.5kbDNA片斷，將該基因片段與大腸桿菌-枯草芽孢桿菌穿梭質(zhì)粒pBE2連接，獲得了重組質(zhì)粒pBE2-chib。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入芽孢桿菌D2中獲得了工程菌株D2-chib。幾丁質(zhì)平板實(shí)驗(yàn)和幾丁質(zhì)酶基因的PCR檢測(cè)表明幾丁質(zhì)酶基因被成功轉(zhuǎn)入D2菌株。構(gòu)造好的工程菌株和原始菌株對(duì)番茄灰霉病的抑制率分別為91.8％，86.7％，工程菌株和原始菌株的抑病作用相比(p＜0.05)有顯著性差異。幾丁質(zhì)酶活在530nm時(shí)測(cè)定，D2-chib菌株原

3、始粗酶液酶活(平均值)為4.06U/ml，是原始菌株酶活的33.8倍，顯著地提高了菌株對(duì)番茄灰霉病的生防效果。
　　 在此基礎(chǔ)上又對(duì)工程菌株的培養(yǎng)基和發(fā)酵條件進(jìn)行了研究和優(yōu)化，在單因素分析的基礎(chǔ)上運(yùn)用正交試驗(yàn)分析找到了最優(yōu)的培養(yǎng)基和發(fā)酵條件。優(yōu)化后的培養(yǎng)基配方為：1％葡萄糖，2％蔗糖，1％酵母膏，4％黃豆餅粉，3％麩皮，0.04％MgSO4，0.4％CaCl2。各個(gè)培養(yǎng)基因素對(duì)發(fā)酵液影響的主次順序?yàn)槠咸烟牵菊崽牵綜aCl2＞麩皮

4、＞酵母膏＞黃豆餅粉＞MgSO4。最優(yōu)的發(fā)酵條件為：5％的接種量，接種種子液的菌齡為24h，搖瓶裝液量30ml，發(fā)酵液初始pH7.2，最佳發(fā)酵時(shí)間為48h。各個(gè)發(fā)酵條件對(duì)發(fā)酵液活性影響的主次順序?yàn)榘l(fā)酵液初始pH值＞細(xì)菌接種量＞種子液菌齡＞搖瓶裝液量。
　　 在最后試驗(yàn)部分本研究把工程菌株的發(fā)酵液應(yīng)用到番茄溫室大棚中。結(jié)果表明其抑制番茄灰霉病的效果顯著，并且找到了最合適的發(fā)酵液稀釋倍數(shù)，100倍的發(fā)酵稀釋液對(duì)番茄灰霉病的抑病率達(dá)到9