CXCR4信號通路在干細(xì)胞介導(dǎo)的心血管修復(fù)中的作用機(jī)制的研究.pdf

1、缺血性心臟病及繼發(fā)的心功能衰竭仍是全球發(fā)病率和死亡率最高的疾病之一。對于這類疾病傳統(tǒng)的治療方法例如血管成形術(shù)，支架及溶栓藥物治療雖可減輕導(dǎo)致缺血的原因但不能對缺血后的心肌損傷進(jìn)行再修復(fù)。目前尚沒有治療藥物或手術(shù)方式能使具有收縮功能的心肌組織替換缺血后的心臟疤痕。最近出現(xiàn)的細(xì)胞治療技術(shù)利用最新鑒定出的祖細(xì)胞群,介導(dǎo)血管及心肌的再生,為缺血性心臟病的治療帶來了新的前景。但是早期大規(guī)模臨床調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)，不論是直接注射祖細(xì)胞到缺血部位還是用藥物

2、動員骨髓祖細(xì)胞到循環(huán)中的細(xì)胞治療方法，臨床治療功效不顯著。研究發(fā)現(xiàn)只有少數(shù)被移植的或被動員(到循環(huán)中)的祖細(xì)胞能駐留在缺血部位，缺血部位的祖細(xì)胞駐留不足是細(xì)胞治療功效不高的主要障礙。而且，目前的細(xì)胞動員藥物并非特異性動員祖細(xì)胞，部分炎癥細(xì)胞也同時被動員到缺血組織，使缺血損傷部位的微環(huán)境惡化，從而破壞祖細(xì)胞的再生能力。因此，加強(qiáng)移植的祖細(xì)胞在缺血部位的招募和停留以及選擇性動員內(nèi)源性骨髓祖細(xì)胞方法的研究對于加強(qiáng)祖細(xì)胞再生能力從而提高細(xì)胞治療

3、的功效具有重要意義。
　　 CXC 趨化因子受體-4 （CXCR4）是G蛋白偶聯(lián)的受體超家族成員之一。CXCR4參與了發(fā)育過程中的心臟和血管器官發(fā)生，造血細(xì)胞的生成，及免疫應(yīng)答等生物活動。最近研究表明CXCR4與其配體基質(zhì)細(xì)胞趨化因子（SDF-1）的相互作用對于調(diào)節(jié)缺血介導(dǎo)的骨髓祖細(xì)胞的招募以及在骨髓微環(huán)境中維持骨髓祖細(xì)胞的穩(wěn)定起重要作用。本課題研究了CXCR4信號通路在維持和動員骨髓祖細(xì)胞中的分子機(jī)制（第一部分）及CXCR4表

4、達(dá)增多對于心肌來源的祖細(xì)胞在缺血的心臟的招募和駐留的調(diào)節(jié)（第二部分）。結(jié)果表明,以CXCR4信號通路為靶點(diǎn)的細(xì)胞治療能加強(qiáng)祖細(xì)胞介導(dǎo)的心血管修復(fù)。
　　 第一部分CXCR4信號通路在維持和動員骨髓祖細(xì)胞中的分子機(jī)制
　　 目的：在骨髓微環(huán)境中，基質(zhì)細(xì)胞趨化因子（SDF-1）及其受體CXC 趨化因子受體-4（CXCR4）的相互作用對于調(diào)節(jié)骨髓祖細(xì)胞 (bone marrow progenitor cell)的動員起重要作用

5、。缺血損傷能破壞SDF-1和CXCR4 之間的相互作用，釋放骨髓祖細(xì)胞到外周循環(huán)，把循環(huán)中的祖細(xì)胞招募到缺血組織從而促進(jìn)血管再生。藥物性CXCR4 阻斷劑AMD3100也能顯著動員骨髓祖細(xì)胞到外周血。但是SDF-1/ CXCR4信號通路的其他傳導(dǎo)途徑目前還不清楚。C-kit是一個細(xì)胞膜上的酪氨酸激酶，干細(xì)胞因子（SCF）的受體，研究發(fā)現(xiàn)c-kit對骨髓祖細(xì)胞的動員和對缺血組織中的修復(fù)中也起著重要作用。因此本實驗研究SDF-1/ CXCR

6、4信號通路與c-kit 激酶活性之間的功能關(guān)系。
　　 方法與結(jié)果：干細(xì)胞克隆形成分析試驗發(fā)現(xiàn)AMD3100既不能動員c-kit基因敲除小鼠的骨髓祖細(xì)胞也不能動員骨髓移植后表達(dá)突變的持續(xù)性激活c-kit小鼠的骨髓祖細(xì)胞。而且，小鼠體內(nèi)皮下注射AMD3100，Western-blotting 結(jié)果表明骨髓中c-kit 激酶的磷酸化活性降低，細(xì)胞流式分析表明CXCR4 減少。在細(xì)胞黏附實驗中，把從小鼠中分離得到的骨髓祖細(xì)胞放在用血管

7、黏附分子（VCAM-1）處理過的細(xì)胞培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，實驗發(fā)現(xiàn)SDF-1和SCF 增加c-kit 激酶的磷酸化活性，AMD3100抑制SDF-1介導(dǎo)的c-kit 激酶活性，但不能抑制SCF 介導(dǎo)的c-kit 激酶活性。還發(fā)現(xiàn)SDF-1介導(dǎo)的c-kit 激酶活性同時還需要激活Src 非受體型酪氨酸激酶：用選擇性Src 激酶抑制劑能阻斷c-kit 激酶的磷酸化活性以及c-kit與Src 激酶之間的相互作用。
　　 結(jié)論：上述結(jié)果表明SD

8、F-1/CXCR4在骨髓微環(huán)境中通過Src 調(diào)節(jié)c-kit 激酶活性,對骨髓祖細(xì)胞動員起調(diào)節(jié)作用。
　　 第二部分CXCR4表達(dá)增多對于心肌來源的祖細(xì)胞在缺血的心臟的招募和駐留的調(diào)節(jié)
　　 目的：心肌缺血導(dǎo)致內(nèi)源性心肌祖細(xì)胞池迅速耗竭，通過注射外源性祖細(xì)胞的細(xì)胞治療方法因為外源性心肌祖細(xì)胞不能有效地被招募到缺血部位而受到限制。最近的報道表明基質(zhì)細(xì)胞趨化因子（SDF-1）及其受體CXC 趨化因子受體-4 （CXCR4）在招

9、募缺血介導(dǎo)的骨髓來源的循環(huán)干細(xì)胞中起關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用，但是CXCR4在心肌祖細(xì)胞中的表達(dá)卻很低。因此，本實驗研究缺氧對心肌祖細(xì)胞CXCR4表達(dá)的影響，經(jīng)缺氧預(yù)處理后的心肌祖細(xì)胞經(jīng)靜脈注射后招募到缺血組織的效率及在小鼠心肌缺血模型中對心功能的保護(hù)作用。方法和結(jié)果：研究發(fā)現(xiàn)缺氧預(yù)處理增加CXCR4在心肌來源的祖細(xì)胞（CLK:Cardiosphere-derived, Lin-/c-kit+progenitor cell）中RNA及蛋白水平的表達(dá)

10、；體外細(xì)胞遷移實驗表明缺氧后顯著地增加CLK細(xì)胞在體外的遷移，同時給予CXCR4小分子干擾RNA后能顯著阻斷此效應(yīng)；在小鼠心肌缺血動物模型中，靜脈注射缺氧預(yù)處理與非缺氧預(yù)處理的CLK細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，缺氧預(yù)處理后的CLK細(xì)胞能更多的被招募到缺血組織，術(shù)后四星期心肌梗死面積顯著減少，心功能顯著提高。而且，給予CXCR4 特異性抑制劑能明顯阻斷上述缺氧預(yù)處理后產(chǎn)生的效應(yīng)。體外細(xì)胞缺氧預(yù)處理發(fā)現(xiàn)，CXCR4的增高依賴于缺氧誘導(dǎo)因子α（HIF-1α），