金葡菌骨科臨床分離株分子分型鑒定及RNAⅢ對γ-溶素的調(diào)控機(jī)制初探.pdf

1、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus, SA），又稱金葡菌，是臨床感染的重要致病菌，在骨科感染病原菌中居首位。金葡菌造成的骨關(guān)節(jié)感染常反復(fù)發(fā)作、遷延不愈，難以控制的骨髓炎(osteomyelitis，OM)是骨科的嚴(yán)重感染性疾病，其復(fù)發(fā)率高，持續(xù)時(shí)間長，骨質(zhì)破壞嚴(yán)重，對患者造成巨大的身體和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。加強(qiáng)病原生物學(xué)研究，從而有效控制骨感染迫在眉睫。
　　病原生物學(xué)研究面臨最大的挑戰(zhàn)是同一種病原菌存在多種多樣的表

2、型，體現(xiàn)在基因組水平上也可有很大差異。金葡菌菌株之間的基因組序列差異高達(dá)22％，所展現(xiàn)的表型極為豐富。根據(jù)金葡菌7個(gè)看家基因的MLST分析，已發(fā)現(xiàn)的金葡菌ST型就有2957種（http://www.mlst.net/），金葡菌主要克隆ST型別在不同國家和地區(qū)流行不一，因此其致病性差異也很大，因此，對金葡菌骨科臨床分離株進(jìn)行分子分型鑒定對于有效控制骨感染具有重要意義。
　　毒力因子(virulence factor)是細(xì)菌致病的重要

3、“武器”之一。金葡菌可產(chǎn)生50種以上毒力因子，引起各種各樣的疾病。γ-溶血素(以下稱γ-溶素，γ-hemolysin)是葡萄球菌產(chǎn)生的一種穿孔毒素(pore-forming toxins，PFTs)，PFTs根據(jù)其跨膜孔洞的二級結(jié)構(gòu)可以分為α螺旋PFTs和β桶狀PFTs，金葡菌可以分泌多種β-PFTs，包括α溶素、γ-溶素、殺白細(xì)胞素，通過在細(xì)胞膜上形成β桶狀孔洞，造成胞內(nèi)物泄漏及細(xì)胞殺傷;除了α-溶素只由單條多肽鏈構(gòu)成外，其他幾種β-

4、PFTs均需F和S組分協(xié)同發(fā)揮作用，γ-溶素、殺白細(xì)胞素的F和S組分分別為LukF和Hlg2、LukF和LukS。γ-溶素類似殺白細(xì)胞素，主要作用于人類和其他哺乳動物的血細(xì)胞等，從而在金葡菌的致病、免疫逃逸等方面發(fā)揮重要作用。
　　RNAⅢ在金葡菌毒力調(diào)控中具有重要作用[14]。RNAⅢ是金葡菌Agr群體感應(yīng)調(diào)控系統(tǒng)的組成成分，也是Agr系統(tǒng)關(guān)鍵的效應(yīng)分子。金葡菌Agr系統(tǒng)由RNAⅡ和RNAⅢ兩個(gè)相鄰的操縱子構(gòu)成，分別由P2、P3

5、啟動子控制轉(zhuǎn)錄。其中，RNAⅢ是由514個(gè)核苷酸構(gòu)成的小RNA分子，可形成14個(gè)發(fā)夾式莖環(huán)結(jié)構(gòu)，調(diào)控著細(xì)菌毒力基因的表達(dá)。幾乎所有分離自急性感染的臨床金葡菌株均可產(chǎn)生RNAⅢ。可通過直接的堿基配對方式正調(diào)控或負(fù)調(diào)控多種毒力因子的表達(dá)。目前已知的金葡菌RNAⅢ可以下調(diào)的分子包括SarH1、LytM、LtaS、寡肽透性酶等，可上調(diào)的分子有殺白細(xì)胞素、腸毒素、胞外蛋白酶、脂酶、尿素酶、mecA等。而γ-溶素是否受到RNAⅢ的調(diào)控尚不明確。

6、r>　　RNAⅢ對毒力因子的調(diào)節(jié)功能可能有一部分是通過控制rot(repressor of toxins)來實(shí)現(xiàn)的。rot由McNamara等利用轉(zhuǎn)座子突變庫篩選并鑒定為一個(gè)調(diào)控因子，可能參與金葡菌毒力因子譜的調(diào)節(jié)，是一個(gè)全局性調(diào)控因子。Boisset等的研究表明，rot表達(dá)受RNAⅢ的負(fù)調(diào)節(jié)。目前尚不清楚RNAⅢ、rot與γ-溶素之間的調(diào)控關(guān)系。
　　研究金葡菌毒力因子的調(diào)控機(jī)制及其變化規(guī)律對理解金葡菌強(qiáng)致病性，及尋找控制金葡菌

7、臨床感染的新策略具有重要的意義。本論文的研究內(nèi)容分為兩部分，第一部分以2013年9月至2015年9月從重慶西南醫(yī)院骨科收集的金葡菌株為研究對象并根據(jù)病歷分為OM組和非OM組，用mecA-femB雙重PCR法鑒定MRSA，并對其進(jìn)行SCCmec、spa、MLST、agr分型并檢測各種毒力因子，評估兩組之間的分子類型，藥物敏感性和毒力因子分布差異，以鑒定與金黃色葡萄球菌OM發(fā)生率相關(guān)的潛在指標(biāo)。并在此基礎(chǔ)上，檢測和比較菌株耐藥譜。第二部分旨

8、在探討RNAⅢ調(diào)控γ-溶血素的分子機(jī)制:利用同源重組的原理分別敲除金葡菌Newman株的γ-溶血素、RNAⅢ、及Rot調(diào)節(jié)蛋白，得到Newman-Δγ、Newman-ΔRNAⅢ及Newman-Δrot敲除株，進(jìn)一步采用q-PCR、western-blot來分析金葡菌RNAⅢ、Rot調(diào)節(jié)蛋白與γ-溶素之間的相互關(guān)系。主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下:
　　1、金葡菌骨科臨床分離株的分子分型鑒定
　　我們將139株來源于重慶西南醫(yī)院骨科的

9、金葡菌分為OM組及非OM組，進(jìn)行了spa、MLST和agr分型鑒定，并檢測了一系列相關(guān)毒力因子。
　　(1)MRSA菌株鑒定:用mecA-femB雙重PCR方法鑒定MRSA。結(jié)果顯示139株菌共有34株MRSA。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，OM組與非OM組之間MRSA菌株差異并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　(2)spa分型:將139株臨床金葡菌進(jìn)行spa分型，并對其結(jié)果進(jìn)行匯總。結(jié)果139株菌株共有54種spa型別，主要型別有t189(17.27％

10、，24/139)和t437(14.39％，20/139)，這兩種型別占所有菌株的31.66％。在兩組中，t189和t437都是最主要的spa類型（10/60，16.7％和14/79，t189為17.7％; t437為8/60，13.3％和12/79，為15.2％）。
　　(3)MLST分型:MLST分型結(jié)果顯示:139株菌株分為33個(gè)型別，其中優(yōu)勢型別為ST188(18.70％，26/139)和ST59(15.83％，22/139

11、)。 OM組(ST3538)和非OM組(ST3539)分別鑒定了一個(gè)新ST。
　　(4)agr分型:結(jié)果顯示139株細(xì)菌中，共檢出agrⅠ型100株(71.94％)，agrⅡ型13株(9.35％)，agrⅢ型14株(10.07％)，agrⅣ型12株(8.63％)。agrⅠ組被確定為兩組中最常見型別（38/60，63.3％和62/79，78.5％），上述所有優(yōu)勢ST和spa型別金黃色葡萄球菌均屬于agrⅠ。agrⅢ/agrⅣ組與OM

12、發(fā)病呈正相關(guān)(p=0.0040)
　　(5)毒力基因及粘附基因檢測:139株菌種顯示24株pvl為陽性，陽性檢出率為18.2％。分析后發(fā)現(xiàn)pvl陽性菌株79.17％(19/24)來自O(shè)M患者，且病程較長。結(jié)果顯示，所有分離株均攜帶至少六種粘附相關(guān)和三種外毒素相關(guān)的毒力基因。
　　2、RNAⅢ調(diào)控γ-溶血素分子機(jī)制的初步探討
　　RNAⅢ是金葡菌群體感應(yīng)系統(tǒng)的細(xì)胞內(nèi)效應(yīng)子，它是已知控制大量毒力基因表達(dá)的最大的調(diào)節(jié)RNA之

13、一。RNAⅢ調(diào)控金葡菌中α-溶血素，腸毒素，酯酶A等一系列毒素。RNAⅢ對毒力因子的調(diào)節(jié)功能可能有一部分是通過控制rot來實(shí)現(xiàn)的。目前尚不清楚RNAⅢ、rot與γ-溶素之間的調(diào)控關(guān)系。我們通過構(gòu)建RNAⅢ和rot的敲除株來研究其對γ-溶血素的調(diào)控機(jī)制。
　　(1)Newman-Δγ、Newman-ΔRNAⅢ和Newman-Δrot敲除株的構(gòu)建
　　采用PCR方法以金葡菌基因組為模板分別擴(kuò)增出所需的目的基因（敲除基因5'端上游

14、600-1000bp，3'端下游600-1000bp），用酶切連接將目的基因克隆入大腸桿菌和金葡菌的穿梭質(zhì)粒PBT2中，構(gòu)建敲除質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化入金葡菌RN4220經(jīng)過修飾后，轉(zhuǎn)入Newman中，誘導(dǎo)、篩選出敲除菌株。
　　(2)q-PCR檢測RNAⅢ、rot在轉(zhuǎn)錄水平上對γ-溶血素的調(diào)控作用
　　采用q-PCR分別檢測γ-溶素基因A、B、C的表達(dá)水平。q-PCR結(jié)果顯示γ-溶素A/B亞基在ΔRNAⅢ中表達(dá)上調(diào)、γ-溶素C亞基在Δ

15、RNAⅢ中表達(dá)下調(diào)。因γ-溶素由A亞基和B亞基，B亞基和C亞基以4+4的形式組成八聚體構(gòu)成，當(dāng)C亞基下調(diào)時(shí)γ-溶素的組成受到到影響呈下調(diào)趨勢，但A、B上調(diào)的幅度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于C下調(diào)幅度，所以，當(dāng)RNAⅢ敲除后γ-溶素的轉(zhuǎn)錄水平是升高的，此結(jié)果表明，RNAⅢ在轉(zhuǎn)錄水平上負(fù)調(diào)控γ-溶素，rot在轉(zhuǎn)錄水平上正調(diào)控γ-溶素。
　　(3)western-blot檢測RNAⅢ、rot在翻譯水平上對γ-溶血素的調(diào)控作用
　　Western-bl

16、ot結(jié)果顯示，γ-溶素A亞基在ΔRNAⅢ敲除株中表達(dá)上調(diào)、γ-溶素B亞基在ΔRNAⅢ敲除株中表達(dá)上調(diào)、γ-溶素C亞基表達(dá)差異不明顯。而這三個(gè)亞基在Δrot敲除株中表達(dá)差異與野生株相比并不明顯。結(jié)果表明，在翻譯水平上，RNAⅢ負(fù)調(diào)控γ-溶素，rot對γ-溶素沒有明顯的調(diào)控作用。
　　綜上，我們將139株來源于重慶西南醫(yī)院骨科的金葡菌分為OM組及非OM組，進(jìn)行分子分型，毒力因子檢測，agr分型，pvl檢測后，評估兩組之間差異，鑒定了與

17、金葡菌OM發(fā)生率相關(guān)的潛在指標(biāo)。本研究豐富了骨科金葡菌分子流行病學(xué)資料，為骨科金葡菌感染監(jiān)控提供了可靠依據(jù)。同時(shí)結(jié)合分子分型及耐藥特征，進(jìn)一步探究其流行原因及耐藥機(jī)制，有助于加強(qiáng)對金葡菌感染的防控。對139株金葡菌進(jìn)行毒力因子檢測后，確定了γ-溶素是普遍存在于金葡菌中的一種毒素，與細(xì)菌的型別之間并不存在相關(guān)關(guān)系。另一方面，我們成功敲除RNAⅢ、rot、γ-溶素基因，并采用q-PCR，western-blot在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上檢測了RNA