流式細(xì)胞術(shù)快速檢測(cè)念珠菌對(duì)唑類藥物敏感性及氟康唑作用機(jī)制的研究.pdf

1、目的：
　　 建立流式細(xì)胞術(shù)快速檢測(cè)念珠菌對(duì)唑類藥物敏感性試驗(yàn)(FCST)的方法，并用CLSI的參考方法進(jìn)行方法學(xué)的評(píng)價(jià)。觀察氟康唑?qū)δ钪榫饔煤?，檢測(cè)真菌細(xì)胞的活性氧、線粒體膜電位變化和細(xì)胞周期變化，初步探討氟康唑在誘導(dǎo)凋亡發(fā)生中的作用。
　　 方法：
　　 以非膜透性染料碘化丙錠(PI)進(jìn)行染色，使用未處理的活菌和乙醇處理的死菌在FL3通道，通過(guò)調(diào)整電壓在SS/log(FL3)圖上進(jìn)行閾門(mén)的設(shè)置把真菌細(xì)胞分成

2、清晰的兩群。
　　 用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)菌株在不同染色條件、菌液濃度、孵育時(shí)間等條件下進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，尋找最適宜的實(shí)驗(yàn)條件。用本實(shí)驗(yàn)室優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)方案和CLSIM27-A2微量稀釋法對(duì)標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行雙份平行藥敏測(cè)定，經(jīng)比對(duì)得出FCST的折點(diǎn)判斷方案，從而建立流式細(xì)胞藥敏試驗(yàn)(FCST)方法。用此方法和CLSIM27-A2微量稀釋法雙份平行檢測(cè)30株臨床分離白色念珠菌的藥敏結(jié)果，評(píng)價(jià)FCST方法和M27-A2的符合性和重復(fù)性。
　

3、　 應(yīng)用建立的FCST方案和M27-A2方法檢測(cè)氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑、酮康唑?qū)?36株臨床分離的念珠菌(白色念珠菌、光滑念珠菌、熱帶念珠菌、近平滑念珠菌、季也蒙念珠菌)的藥敏結(jié)果，通過(guò)MIC分布情況、MIC符合率、耐藥符合率等方面進(jìn)行對(duì)比，來(lái)評(píng)估FCST方案的方法學(xué)。
　　 檢測(cè)氟康唑敏感性不同的臨床菌株(白色念珠菌、光滑念珠菌、熱帶念珠菌)在不同濃度的氟康唑共同培養(yǎng)后，用流式細(xì)胞術(shù)來(lái)分析檢測(cè)凋亡相關(guān)的參數(shù)：熒光探針雙氫

4、羅丹明(DHR)標(biāo)記ROS、熒光探針?biāo)穆人囊一讲⑦溥蚧驶ㄇ嗟饣?JC-1)標(biāo)記線粒體△Ψm的變化和DNA-Prep試劑盒標(biāo)記細(xì)胞周期。
　　 應(yīng)用抗氧化物質(zhì)谷胱苷肽和氟康唑與氟康唑敏感的熱帶念珠菌共同培養(yǎng)檢測(cè)ROS和細(xì)胞周期的變化，觀察抗氧化物質(zhì)抑制凋亡發(fā)生變化。
　　 結(jié)果：
　　 經(jīng)過(guò)調(diào)整電壓后通過(guò)閾門(mén)的設(shè)置，把活菌與死菌在SS/log(FL3)圖上分為兩群分界清晰的細(xì)胞，對(duì)不同比例死菌與活菌混合液檢測(cè)

5、值與設(shè)定值具有良好的相關(guān)性(r=0.999)。
　　 經(jīng)過(guò)不同條件測(cè)試后，實(shí)驗(yàn)表明在菌液濃度1．O×106CFU/ml，孵育時(shí)間為3小時(shí)，在培養(yǎng)物離心后，取沉淀物加入200μ1PI和20μ1去氧膽酸鈉染色5-10分鐘時(shí)可得到良好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。MIC折點(diǎn)判斷標(biāo)準(zhǔn)為死菌比率在連續(xù)系列管中高濃度管比低濃度管出現(xiàn)一倍以上的增長(zhǎng)，并且保持穩(wěn)定或連續(xù)增長(zhǎng)，則可判定高濃度管藥物濃度為該菌的MIC值。臨床菌株驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，本法有很好的重復(fù)性，優(yōu)于M2

6、7-A2方案，MIC結(jié)果與M27-A2微量法比較，兩者一致率為93.3％，相關(guān)性很好(r=0.822)，差異無(wú)顯著性(P=0.135)。
　　 FCST法和CLSIM27-A2微量稀釋法同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)四種藥物的MIC范圍一致，但是M27-A2法測(cè)定的MIC50和MIC90均高于FCST法。四種藥物的MIC符合率發(fā)現(xiàn)氟康唑和酮康唑兩種方法的符合率較高，而伊曲康唑兩種方案的符合率稍差，為77.3％。從耐藥符合率來(lái)看，除伏立康唑外的三種

7、藥物均符合率均在90％以上，總體來(lái)說(shuō)，流式細(xì)胞術(shù)在唑類藥物的抗真菌藥敏結(jié)果與M27-A2符合率較好。
　　 三種氟康唑耐藥的念珠菌，在氟康唑作用后，細(xì)胞周期、ROS和線粒體△Ψm均沒(méi)有明顯變化：而氟康唑敏感株的ROS水平隨氟康唑的濃度增加而升高，有一定的劑量依賴關(guān)系；細(xì)胞周期進(jìn)程明顯受影響，大部分念珠菌阻滯在G2/M期，呈一定的劑量效應(yīng)關(guān)系，并出現(xiàn)SubGl凋亡峰。白色念珠菌和熱帶念珠菌的線粒體△Ψm隨氟康唑的濃度增加而降低，光

8、滑念珠菌的線粒體△Ψm隨氟康唑的濃度增加而升高。
　　 谷胱苷肽在低濃度氟康唑時(shí)可以較好的清除ROS，但隨著氟康唑濃度的升高，谷胱苷肽清除ROS能力有所下降。G2/M期在0.5～8μg/ml時(shí)明顯降低，但在高濃度氟康唑時(shí)G2/M期變化不大，但是凋亡峰的數(shù)量明顯降低。
　　 結(jié)論：
　　 本研究建立的FCST具有快速、重復(fù)性好、易于判斷MIC值、準(zhǔn)確性高等優(yōu)點(diǎn)，在臨床抗真菌藥物敏感性檢測(cè)中具有很大的應(yīng)用前景。氟康唑