基于熒光納米標(biāo)記與介電泳技術(shù)的細(xì)胞體系檢測(cè)研究.pdf

1、細(xì)胞體系的檢測(cè)與食品安全檢測(cè)、疾病診斷、環(huán)境監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域息息相關(guān),因此,快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)細(xì)胞體系具有舉足輕重的意義。目前,細(xì)胞體系檢測(cè)的常用方法主要包括熒光分析法、酶聯(lián)免疫分析法、生物傳感器、流式細(xì)胞術(shù)等。這些方法在縮短檢測(cè)時(shí)間、提高檢測(cè)靈敏度和準(zhǔn)確性等方面作出了重要貢獻(xiàn)。然而,在將這些方法用于細(xì)胞體系檢測(cè)時(shí),通常還存在著樣品需要預(yù)富集、信號(hào)強(qiáng)度受限制等缺陷。因此,待測(cè)樣品在同步檢測(cè)過(guò)程中實(shí)現(xiàn)有效分離與富集以及增強(qiáng)檢測(cè)過(guò)程中獲取信號(hào)的強(qiáng)度

2、對(duì)于建立快速、靈敏的細(xì)胞體系檢測(cè)新技術(shù)十分必要。近年來(lái),具有高熒光強(qiáng)度和較好光穩(wěn)定性的熒光納米粒顆粒已被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)分析領(lǐng)域,相對(duì)于傳統(tǒng)的標(biāo)記方法,功能化熒光納米顆粒標(biāo)記技術(shù)能大大提高檢測(cè)靈敏度和光穩(wěn)定性;同時(shí),介電泳理論和微電加工技術(shù)的快速發(fā)展,為樣品中少量細(xì)胞作為對(duì)象的超靈敏檢測(cè)提供了新的契機(jī)。本論文瞄準(zhǔn)細(xì)胞體系的快速、靈敏檢測(cè)這一重要研究方向,在對(duì)細(xì)胞體系主要是病原菌細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞檢測(cè)方法進(jìn)行簡(jiǎn)要綜述的基礎(chǔ)上,以熒光納米顆粒

3、標(biāo)記、核酸適體探針識(shí)別特性與介電泳富集技術(shù)用于大腸桿菌O157:H7、CEM細(xì)胞等重要細(xì)胞的快速、靈敏檢測(cè)為主線,主要開(kāi)展了以下幾個(gè)方面的研究工作:
　　 1、生物修飾的熒光二氧化硅納米顆粒對(duì)大腸桿菌O157:H7介電性質(zhì)的影響
　　 設(shè)計(jì)并利用拋物線電極研究了生物修飾的熒光二氧化硅納米顆粒結(jié)合到大腸桿菌O157:H7表面后對(duì)大腸桿菌O157:H7介電性質(zhì)所產(chǎn)生的影響。通過(guò)考察50 KHz-100 MHz的頻率范圍內(nèi)大腸

4、桿菌O157:H7和表面結(jié)合了生物修飾的二氧化硅納米顆粒后的大腸桿菌O157:H7的介電泳行為,發(fā)現(xiàn)大腸桿菌O157:H7在50 KHz-80 MHz頻率范圍內(nèi)表現(xiàn)為正介電泳行為,在90MHz-100MHz頻率范圍內(nèi)表現(xiàn)為負(fù)介電泳行為;結(jié)合了生物修飾的二氧化硅納米顆粒后的大腸桿菌0157:H7在50KHz-60MHz頻率范圍內(nèi)表現(xiàn)為正介電泳行為,在70MHz-100MHz頻率范圍內(nèi)表現(xiàn)為負(fù)介電泳行為。研究結(jié)果表明結(jié)合生物修飾的熒光二氧化

5、硅納米顆粒后,大腸桿菌O157:H7的正負(fù)介電泳的臨界頻率從90MHz變成70MHz,生物修飾的納米顆粒結(jié)合在大腸桿菌O157:H7表面后對(duì)大腸桿菌O157:H7的介電性質(zhì)產(chǎn)生了一定影響。該研究工作為用介電泳富集技術(shù)快速、靈敏檢測(cè)大腸桿菌O157:H7細(xì)胞打下了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　 2、基于介電泳富集技術(shù)和熒光納米顆粒信號(hào)增強(qiáng)的微流控大腸桿菌O157:H7檢測(cè)研究
　　 在研究生物修飾的熒光二氧化硅納米顆粒對(duì)大腸桿菌O157

6、:H7介電性質(zhì)的影響基礎(chǔ)上,提出了一種結(jié)合熒光納米顆粒標(biāo)記和介電泳在線富集技術(shù)的快速、靈敏、方便的微流控檢測(cè)病原菌新方法。以大腸桿菌O157:H7為檢測(cè)對(duì)象,通過(guò)采用具有信號(hào)增強(qiáng)作用的包裹釕吡啶熒光染料的羧基化二氧化硅納米顆粒修飾識(shí)別大腸桿菌O157:H7的特異性抗體,實(shí)現(xiàn)對(duì)大腸桿菌O157:H7的選擇性結(jié)合與識(shí)別,在此基礎(chǔ)上,在特定頻率的交流電場(chǎng)下,利用設(shè)計(jì)的微流控芯片對(duì)標(biāo)記生物修飾的熒光納米顆粒的大腸桿菌O157:H7進(jìn)行定向富集,

7、再通過(guò)測(cè)量富集區(qū)域熒光信號(hào)的強(qiáng)度,實(shí)現(xiàn)對(duì)大腸桿菌O157:H7進(jìn)行定量檢測(cè)。由于未與大腸桿菌O157:H7結(jié)合的納米顆粒不會(huì)表現(xiàn)正介電泳行為,在微流控芯片中直接被沖走。因此,這種新方法成功地將需要去除多余熒光納米顆粒的分離與洗滌過(guò)程整合到檢測(cè)過(guò)程中。該方法對(duì)大腸桿菌O157:H7檢測(cè)的線性范圍為4.2x102～4.2×106cfu/mL,對(duì)去離子水中大腸桿菌O157:H7的檢測(cè)限為64cfu/mL。同時(shí),我們?cè)谌斯の廴镜膶?shí)際水樣品中能精

8、確檢測(cè)到420cfu/mL的大腸桿菌O157:H7。該方法的整個(gè)檢測(cè)過(guò)程可以在80min內(nèi)完成,為實(shí)現(xiàn)在食物、水中和環(huán)境樣品快速、靈敏、低成本地檢測(cè)病原菌的方法提供了契機(jī)。
　　 3、基于介電泳富集技術(shù)和Aptamer識(shí)別特性的CEM細(xì)胞檢測(cè)研究
　　 將核酸適體探針(Aptamer)對(duì)腫瘤細(xì)胞的特異性識(shí)別與結(jié)合作用和介電泳富集技術(shù)相結(jié)合,發(fā)展了一種新型的基于核酸適體探針識(shí)別特性與介電泳富集技術(shù)的CEM細(xì)胞檢測(cè)方法。通過(guò)

9、采用FAM-sgc8c核酸適體探針對(duì)目標(biāo)CEM細(xì)胞進(jìn)行特異性識(shí)別后,將其加入到設(shè)計(jì)好的電極芯片上,用波形/函數(shù)發(fā)生器提供一定的電壓與頻率,通過(guò)介電泳力將FAM-sgc8c識(shí)別的CEM細(xì)胞富集在檢測(cè)區(qū)域,采用熒光顯微鏡對(duì)聚集的CEM細(xì)胞進(jìn)行熒光成像檢測(cè)。結(jié)果表明,該方法可以成功應(yīng)用于在緩沖液體系中檢測(cè)CEM細(xì)胞,檢測(cè)線性范圍是8.1×104-1.2×106cells/mL,在10μL5％蔗糖溶液的緩沖液中最低可檢測(cè)到1200個(gè)CEM細(xì)胞。