龜板有效成分促間充質(zhì)干細胞成骨分化的miRNA-VDR網(wǎng)絡(luò)機制.pdf

1、目的:
　　骨髓間充質(zhì)干細胞(Bone mesenchymal stem cells，BMSCs)是目前研究最多、應(yīng)用潛力最大的干細胞之一，是研究增殖與分化機理的理想模型。但是，骨髓中BMSCs含量極少，長期增殖活性弱，擴增速度慢，逐漸向脂肪老化，無法滿足大量的臨床需求。眾多的體外轉(zhuǎn)染和體內(nèi)移植研究表明，移植的BMSCs增殖活力不夠，存活量較少，嚴重限制了BMSCs的應(yīng)用研究。而且BMSCs成骨活性弱，骨化過程較慢，因此，如何提高

2、BMSCs的成骨潛能是近年來研究的熱點。
　　補腎中藥提取物龜板提取物及其有效成分可以誘導(dǎo)干細胞向成骨分化。近幾年來本課題組著重探討了補腎龜板對各類干細胞的定向分化作用。積累了豐富的前期研究工作基礎(chǔ)。前期研究發(fā)現(xiàn)龜板提取物促進BMSCs向成骨分化可能與其內(nèi)的小分子脂肪酸類、脂肪酸酯類、甾體直接進入細胞膜作用內(nèi)部核受體有關(guān)。龜板提取物可上調(diào)BMSCs定向成骨分化過程中維生素D受體(vitamin D responsive，VDR)的

3、表達，這在一定的程度上揭示龜板促進BMSCs定向成骨分化的可能機制。因此，本研究在前期工作的基礎(chǔ)上深入研究探索龜板提取物及其有效成分靶向VDR對骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化作用的分子機制研究。
　　方法:
　　1.通過lncRNA芯片技術(shù)分析龜板有效成分差異性表達情況，運用生物信息學(xué)方法，預(yù)測分析差異性表達的IncRNA共表達基因，預(yù)測分析其共表達的靶基因，運用生物學(xué)功能聚類分析的方法了解其參與成骨分化的相關(guān)情況，通過trans

4、和cis預(yù)測分析差異性lncRNA參與基因的調(diào)控機制，構(gòu)建TF-IncRNA-靶基因三者的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系。
　　2.構(gòu)建了維生素D受體反應(yīng)元件(vitamin D responsive element，VDRE)驅(qū)動的熒光素酶(Luc)報告基因系統(tǒng)，確定了VDR這一核受體靶基因?qū)敯宕俪晒欠只钚猿煞址磻?yīng)元件，尋找出促BMSCs成骨分化的最佳龜板提取物(PTE)組分。
　　3.轉(zhuǎn)染維生素D受體(VDR)與其功能區(qū)截斷體到骨髓間充質(zhì)

5、干細胞(BMSCs)中，觀察何種核受體功能區(qū)在龜板有效成分促成骨分化中起作用。
　　4.以龜板提取物及其有效成分干預(yù)BMSCs，正常BMSCs作為對照組，通過miRNA基因芯片篩查及qRT-PCR進行驗證，發(fā)現(xiàn)成骨分化方面有關(guān)的miRNA信息。
　　5.結(jié)合前面miRNA基因芯片和qRT-PCR信息，篩選出miRNA-351，其靶基因為VDR mRNA，特引入rno-miR-351 mimic與預(yù)測靶基因VDR3'UTR雙熒

6、光素酶檢測，以驗證miRNA是否抑制候選靶基因翻譯水平。
　　結(jié)果:
　　1.通過lncRNA基因芯片的分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)了龜板有效成分差異性表達的lncRNA和mRNA。
　　2.pathway和GO聚類分析確定了分子之間的生物學(xué)功能，并進一步分析了龜板有效成分差異性表達的lncRNA與TF及cis調(diào)控的關(guān)系。
　　3.通過trans分析，構(gòu)建了lncRNA-mRNA-轉(zhuǎn)錄因子三元共調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。
　　4.時效表達

7、初步結(jié)論:各組分均有不同程度的促進作用。不同劑量的結(jié)構(gòu)類似物在藥物作用最佳時間點，有不同程度的促進作用，30μg/mL對VDRE的表達效率最高。
　　5.4甾酮(S9)是作用于VDR的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(pCMV-Myc-VDR-C)而促進BMSCs成骨分化的。
　　6.經(jīng)過基因芯片檢測數(shù)據(jù)進行分析，我們發(fā)現(xiàn)經(jīng)過龜板總提取物(2B)、S9干預(yù)后，miRNA-330-3p、miRNA-200a-5p、miRNA-296-3p表達上

8、調(diào)，同時miRNA-615、miRNA-351-3p、miRNA-129-1-3p、miRNA-466b-2-3p、miRNA-466b-1-3p表達下調(diào)。
　　7.篩選出的miRNA-351模擬物可有效抑制VDR的表達，而在轉(zhuǎn)染miRNA-351抑制劑組則可促進VDR蛋白的表達，miRNA-351與VDR有相應(yīng)的結(jié)合位點，能在其翻譯水平有效抑制VDR的表達。
　　結(jié)論:
　　祖國傳統(tǒng)中藥龜板提取物及其有效成分可靶向V