金黃色葡萄球菌PSMs的調(diào)控機制解析及毒性因子的篩選.pdf

1、金黃色葡萄球菌是人類與動物的一類主要細菌病原體，能夠引起多種感染性疾病，包括輕微感染以及致命的全身性感染，金黃色葡萄球菌分泌的多種毒性因子參與了相應的致病過程。同時，金黃色葡萄球菌能夠在組織及醫(yī)療設(shè)備上形成生物被膜，引起生物被膜相關(guān)的感染性疾病。生物被膜能夠為細菌提供一個抵抗抗生素以及宿主免疫系統(tǒng)作用的環(huán)境，使得生物被膜相關(guān)的感染更為嚴重并且難以治療。此外，生物被膜發(fā)育到一定階段會發(fā)生解離，使得生物被膜中的細菌能夠通過血液等體液擴散至新

2、的感染部位引起全身性感染。
　　在金黃色葡萄球菌致病以及生物被膜發(fā)育過程中，酚可溶性蛋白(PSMs)發(fā)揮著重要作用。雖然在金黃色葡萄球菌中PSMs的功能已經(jīng)被廣泛研究并報道，但是其編碼基因的表達調(diào)控機制仍然未被詳細闡釋。本論文主要研究了參與PSMs編碼基因調(diào)控的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。首先，我們通過DNA Pull-down的實驗方法，鑒定了一個可能參與PSMs編碼基因調(diào)控的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子MgrA;在體外，利用凝膠電泳阻滯實驗(EMSA)和D

3、NaseⅠ足跡實驗驗證了MgrA作為轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子與psm操縱子啟動子結(jié)合的特異性以及相應的特異性結(jié)合序列;通過在野生型菌株中對mgrA進行敲除，利用實時熒光定量PCR實驗方法檢測PSM編碼基因的轉(zhuǎn)錄水平，并利用反相超高效液相色譜實驗在蛋白質(zhì)水平檢測PSMs的表達量。結(jié)果顯示，MgrA是一個psm基因的轉(zhuǎn)錄負調(diào)因子，能夠抑制psm操縱子的轉(zhuǎn)錄從而影響PSMs的產(chǎn)生;通過分析mgrA突變菌株和野生型菌株在靜態(tài)及動態(tài)條件下生物被膜的形成及解離

4、情況，我們發(fā)現(xiàn)MgrA作為一個生物被膜調(diào)控因子不僅能夠抑制生物被膜的形成，同時也抑制生物被膜的解離，這與其對PSMs的調(diào)控功能相一致。另外我們還檢測了細菌培養(yǎng)液濾過液的溶血能力，結(jié)果顯示mgrA突變菌株細菌培養(yǎng)液濾過液溶血能力明顯增強，進一步證明MgrA對PSMs表達的負調(diào)控功能。這些結(jié)果表明，MgrA通過與psm操縱子啟動子區(qū)域結(jié)合抑制PSMs的表達，進而調(diào)控生物被膜的形成與解離。
　　金黃色葡萄球菌侵染宿主過程中，其表達分泌的

5、多種的毒性因子發(fā)揮著重要作用。然而，目前對金黃色葡萄球菌已知毒性因子的研究還不足以全面解釋其致病機制。在金黃色葡萄球菌中仍有許多未知的毒性因子以及毒性調(diào)控因子，它們的功能和在致病過程中的作用未被闡釋。本論文的部分工作專注于金黃色葡萄球菌中毒性因子的篩選及其功能與致病性研究。我們利用轉(zhuǎn)座子突變技術(shù)在金黃色葡萄球菌高毒力菌株MW2中構(gòu)建了的一個himar1轉(zhuǎn)座子突變體庫;建立了金黃色葡萄球菌秀麗隱桿線蟲殺傷模型并用于高通量篩選毒性因子;利用