鰱低氧應(yīng)激相關(guān)基礎(chǔ)的克隆與表達(dá)分析.pdf

1、工農(nóng)業(yè)的快速發(fā)展已經(jīng)導(dǎo)致淡水養(yǎng)殖用水水質(zhì)的嚴(yán)重惡化,水體中氧的承載力也極度下降,造成水生生物頻繁產(chǎn)生缺氧應(yīng)激反應(yīng),影響水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)量。鰱(Hyphthalmichthys molitrix)是我國(guó)淡水養(yǎng)殖的主要種類,在我國(guó)淡水水域廣泛分布。鰱性燥,在各種應(yīng)激刺激后即跳躍出水,耐低氧能力差,易發(fā)生大面積翻塘,在長(zhǎng)期的養(yǎng)殖實(shí)踐中造成了巨大的損失。因此探討鰱低氧脅迫下的應(yīng)激機(jī)制對(duì)于理解其生理特性以及抗低氧應(yīng)激新品種選育很有意義。本研究,以遺傳背

2、景非常一致的雌核發(fā)育鰱后代為實(shí)驗(yàn)材料,通過同源克隆,獲得三個(gè)已知在低氧脅迫應(yīng)激中扮演重要角色的功能基因(HIF-1α,SODs,Tf)的cDNA全長(zhǎng)序列,通過序列分析,預(yù)測(cè)其蛋白結(jié)構(gòu)及功能。采用SYBR—greenⅠ熒光定量PCR技術(shù)研究了上述功能基因在組織表達(dá)差異,胚胎發(fā)育表達(dá)等以及在急性低氧脅迫處理后0h,3h,6h,9h,12h,15h,18h等的mRNA表達(dá)水平在肝臟和鰓中的變化。結(jié)果表明:
　　 (1)克隆得到鰱HIF

3、-1α基因的cDNA全序列,長(zhǎng)3828 bp,最大開放閱讀框長(zhǎng)2325 bp,編碼774個(gè)氨基酸。鰱HIF-1α與草魚具有最高的氨基酸序列一致性達(dá)到95％,其次為團(tuán)頭魴(95％),鯉魚(90％),麥穗魚(90％),斑馬魚(88％),可見HIF-1α在鯉科魚類中高度保守,鰱HIF-1α同非鯉科魚類的氨基酸序列一致性也達(dá)到了60％-75％,而同哺乳動(dòng)物的氨基酸一致性也有57％。保守結(jié)構(gòu)域分析表明,鰱氨基酸序列,具有bHLH結(jié)構(gòu)域,兩個(gè)PAS

4、結(jié)構(gòu)域,C-TAD保守結(jié)構(gòu)域以及一段可以被pVHL泛素化識(shí)別的靶序列,具備HIF-1α基因的主要功能結(jié)構(gòu)域。
　　 鰱HIF-1α在各個(gè)組織均有分布,但具有組織特異性,在心臟,腦,肌肉,鰓中的表達(dá)量較高,而在肝臟,腎臟,脾臟的表達(dá)量均較低。鰱HIF-1α的表達(dá)貫穿胚胎發(fā)育的整個(gè)過程,是一種高度動(dòng)態(tài)的表達(dá)模式,于細(xì)胞分裂期(2-4細(xì)胞)表達(dá)量最高(p<0.05),之后明顯降低(p<0.05)。在肝臟中,HIF-1α在低氧脅迫9小時(shí)

5、后表達(dá)量明顯增高,并保持增加的趨勢(shì)直至最后(增加50倍)。而在鰓中,HIF-1α低氧脅迫3小時(shí)后,表達(dá)量開始增加,到12小時(shí)達(dá)到最大值(15倍),之后,逐漸減少,到最后降低到正常對(duì)照組的表達(dá)水平。結(jié)果表明,鰱HIF-1α基因具備低氧誘導(dǎo)因子家族的主要特征,在鰱的低氧適應(yīng)反應(yīng)中通過轉(zhuǎn)錄水平上的變化,從而通過誘導(dǎo)參與各生命過程的靶基因的表達(dá)變化來完成機(jī)體對(duì)低氧脅迫應(yīng)激的適應(yīng),而其調(diào)控表達(dá)模式也具備組織特異性。
　　 (2)克隆得到鰱

6、Cu/Zn-SOD cDNA全長(zhǎng)753 bp,編碼154個(gè)氨基酸；Mn-SODcDNA序列全長(zhǎng)1008 bp,編碼224個(gè)氨基酸。兩個(gè)基因序列上均有Kozak序列及加尾信號(hào)多聚腺苷酸,證明了克隆序列的完整性。通過氨基酸序列分析,鰱Cu/Zn-SOD和Mn-SOD具備各自的特征片段,以及保守的金屬輔因子結(jié)合位點(diǎn)。
　　 鰱Cu/Zn-SOD和Mn-SOD在心臟、腦、肝臟、腎臟、脾臟、鰓、肌肉、血液八種組織中均表達(dá),其中Cu/Zn-

7、SOD在肝臟和脾臟中大量表達(dá),而Mn—SOD則在鰓中有最高的表達(dá)量。在胚胎發(fā)育過程中,兩個(gè)基因均在桑葚期達(dá)到最高水平,于囊胚期表達(dá)量開始下降。在肝臟,Cu/Zn—SOD和Mn-SOD在急性低氧脅迫開始的3個(gè)小時(shí)內(nèi)的mRNA表達(dá)水平增高,之后開始降低,并一直保持較低的表達(dá)水平直到最后。在鰓中,Cu/Zn-SOD的表達(dá)水平在低氧脅迫開始后就持續(xù)增加直到實(shí)驗(yàn)結(jié)束,而Mn-SOD的表達(dá)則相對(duì)比較動(dòng)態(tài)化,沒有明顯的增加或減少的趨勢(shì)。結(jié)果表明SOD

8、s的組織特異性表達(dá)變化對(duì)于鰱低氧應(yīng)激的適應(yīng)起到至關(guān)重要的作用。
　　 (3)克隆得到鰱Tf cDNA全長(zhǎng)2365 bp,最大開放閱讀框2025 bp,編碼674個(gè)氨基酸。蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析,在N端21個(gè)氨基酸為信號(hào)肽,長(zhǎng)14個(gè)氨基酸,第24至327個(gè)氨基酸以及第335至665個(gè)氨基酸為兩個(gè)保守的結(jié)構(gòu)域。鰱轉(zhuǎn)鐵蛋白與草魚轉(zhuǎn)鐵蛋白的同源性高達(dá)74％,與人轉(zhuǎn)鐵蛋白同源性最低,為39％,其他鯉科魚類轉(zhuǎn)鐵蛋白的同源性約65％-73％,與非鯉

9、科魚類的同源性約43％-50％。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析顯示,鰱轉(zhuǎn)鐵蛋白基因與斑馬魚、鯉魚、鯽魚、草魚等幾種鯉科魚類親緣關(guān)系最近,單獨(dú)聚為一支。
　　 鰱轉(zhuǎn)鐵蛋白基因僅在肝臟和脾臟中表達(dá),肝臟中表達(dá)量最高,脾臟次之,在心臟、腦、腎臟、肌肉、鰓、血液中均不表達(dá)。在胚胎發(fā)育過程中,轉(zhuǎn)鐵蛋白基因?qū)υc中期后的器官分化和形態(tài)建成起到了一定的作用,而未影響原腸中期前的細(xì)胞分裂增殖。
　　 本研究第一次克隆得到鰱三個(gè)功能基因HIF-1α,SO