扁蓿豆抗寒相關(guān)基因的克隆與表達(dá)分析.pdf

1、深入挖掘苜蓿屬牧草的抗寒基因資源，揭示其抗寒機(jī)理，為苜蓿屬牧草的抗寒育種研究提供理論依據(jù)。以該屬抗寒性較強(qiáng)的直立型扁蓿豆為材料，低溫冷誘導(dǎo)3-5葉期幼苗，利用cDNA-AFLP和RT-PCR同源序列克隆技術(shù)，篩選克隆扁蓿豆抗寒相關(guān)基因，進(jìn)一步通過熒光定量 PCR技術(shù)和生理生化指標(biāo)測定，分析扁蓿豆抗寒相關(guān)基因與其他植物抗寒基因的差異、表達(dá)時(shí)期及基因表達(dá)與生理生化指標(biāo)間的相關(guān)性等表達(dá)特性，為明確其抗寒機(jī)理奠定基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下：

2、　　1．直立型扁蓿豆幼苗的葉、莖、根對低溫有不同程度的響應(yīng)，可溶性糖含量和POD活性最先在根中提高，最高水平量是對照可溶性糖和POD活性量的3.64和1.64倍；可溶性蛋白和SOD活性最先在葉中提高，最高水平量是對照可溶性蛋白和SOD活性量的1.52和2.12倍。可溶性蛋白、SOD酶活性和POD酶活性間存在顯著相關(guān)性，說明扁蓿豆在低溫脅迫條件下提高滲透物質(zhì)含量和抗氧化物酶活性來抵御寒冷。
　　2．通過RT-PCR技術(shù)同源克隆得到扁

3、蓿豆Actin、CAS15A和CAS15B基因，與苜蓿的Actin和CAS基因相似率高達(dá)93%以上。其中扁蓿豆Actin基因在不同溫度處理下的葉、莖、根中表達(dá)均無差異，可作為后期定量分析的內(nèi)參基因；扁蓿豆 CAS基因的核苷酸序列含有CRT/DRE（TACCGACCA）低溫應(yīng)答元件，同時(shí)氨基酸序列具有與其他植物CAS基因相似的4個(gè)相關(guān)位點(diǎn)、4次重復(fù)的10肽序列的低溫相關(guān)位點(diǎn)和序列；扁蓿豆CAS15基因?qū)儆贑AS冷誘導(dǎo)基因家族，隨著低溫脅迫

4、時(shí)間的延長表達(dá)量呈現(xiàn)上升趨勢，并在冷處理72h和84h達(dá)到相關(guān)表達(dá)量最高水平，推測CAS15的表達(dá)增強(qiáng)了扁蓿豆的抗寒性。
　　3．采用EcoRⅠ和MseⅠ為限制性內(nèi)切酶建立扁蓿豆的cDNA-AFLP反應(yīng)體系，用于扁蓿豆低溫誘導(dǎo)基因差異表達(dá)的研究。選取其中58條上調(diào)表達(dá)的差異片段進(jìn)行功能預(yù)測，主要參與光合作用、呼吸反應(yīng)、細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、物質(zhì)代謝、防御反應(yīng)等生理過程，其中70.79%的差異片段序列與蒺藜苜蓿的相關(guān)序列高度一致。通過qRT

5、-PCR對其中7個(gè)有特點(diǎn)的基因進(jìn)行量化分析證實(shí)均參與低溫調(diào)控。
　　4．利用 RACE技術(shù)獲得扁蓿豆抗寒相關(guān)的 MRPP2C、MRHSP70、MRHLH的cDNA，其編碼蛋白分別具有 PP2C、HSP70、HLH的保守域，與蒺藜苜蓿及其他植物的相應(yīng)基因編碼氨基酸序列具有很高相似度。在低溫處理84h內(nèi)，3個(gè)基因在扁蓿豆幼苗中的表達(dá)量變化趨勢相似，均出現(xiàn)了2個(gè)峰值。其中MRHLH與MRCAS15基因表達(dá)量呈顯著正相關(guān)，SOD酶活性也與