紅豆越桔抗寒相關(guān)基因VviCOR11和VviDREB1的克隆、表達(dá)及功能分析.pdf

1、脫水蛋白是植物在脫水、低溫、冷凍、滲透脅迫、脫落酸處理和種子成熟時(shí)積累的一類典型的具有獨(dú)特免疫學(xué)特征的植物蛋白，屬于LEA D11或LEAⅡ蛋白家族。CBF/DREB1(C-repeat binding factor/dehydration responsive element binding factor1)轉(zhuǎn)錄因子是CBF抗寒途徑中的一個(gè)主控開關(guān)基因，可激活一系列包括脫水蛋白等抗寒功能基因的表達(dá)，提高植株的抗寒性。
　　紅豆越

2、桔（Vaccinium vitis-idaea L.）又稱越桔，為杜鵑花科越桔屬多年生常綠矮小灌木。分布于我國(guó)東北、新疆和北歐、北美等環(huán)北極地區(qū)。冬季可耐-50℃極端低溫，是一種極其寶貴的抗寒資源，但對(duì)其抗寒機(jī)理了解甚少。為了解紅豆越桔的抗寒機(jī)理，通過cDNA末端快速擴(kuò)增（RACE）和基因組步移技術(shù)，我們克隆了紅豆越桔CBF抗寒途徑中的一個(gè)主控開關(guān)基因VviDREB1和它下游的一個(gè)功能蛋白基因VviCOR11。利用生物信息學(xué)分析了這兩個(gè)

3、基因及其啟動(dòng)子序列結(jié)構(gòu)和功能，并進(jìn)行了洋蔥表皮細(xì)胞的亞細(xì)胞定位和熒光定量RT-PCR表達(dá)分析，在模式植物煙草（Nicotiana）中進(jìn)行異源表達(dá)分析，并對(duì)其啟動(dòng)子做了缺失和瞬時(shí)表達(dá)實(shí)驗(yàn)，揭示了紅豆越桔植物中CBF抗寒途徑的存在及其部分抗寒機(jī)理，并為今后利用這兩個(gè)抗寒相關(guān)基因進(jìn)行觀賞植物抗寒品種的改良提供理論依據(jù)。主要研究結(jié)果如下:
　　1通過同源克隆技術(shù)成功地克隆了紅豆越桔KS型脫水蛋白VviCOR11基因的cDNA序列，全長(zhǎng)56

4、7 bp，沒有內(nèi)含子，是一個(gè)編碼108個(gè)氨基酸的親水性蛋白。洋蔥表皮細(xì)胞的亞細(xì)胞定位實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明VviCOR11基因被定位在細(xì)胞核上。實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，紅豆越桔組培苗VviCOR11在常溫下能夠表達(dá)，并受低溫、NaCl和ABA誘導(dǎo)，在12 h達(dá)到最大值，其中NaCl和ABA處理表達(dá)強(qiáng)烈，接近對(duì)照表達(dá)量的5倍和7倍。
　　2為探明紅豆越桔VviCOR11基因的表達(dá)調(diào)控規(guī)律，在VviCOR11基因cDNA序列的基礎(chǔ)

5、上，應(yīng)用接頭介導(dǎo)的基因組步移技術(shù)，從紅豆越桔中克隆了一條長(zhǎng)1584 bp，包含有VviCOR11完整ORF序列的5'側(cè)翼序列（GenBank登錄號(hào)為FJ429387）。經(jīng)PLACE、PlantCARE在線啟動(dòng)子預(yù)測(cè)工具分析表明:該序列含有5UTR Pyrich stretch序列和啟動(dòng)子的特定結(jié)構(gòu)，如TATA-box、CAAT-box等，保證轉(zhuǎn)錄的精確起始。在此序列中發(fā)現(xiàn)有ABRE、LTR、TC-rich repeats、ARE、MYB

6、（或MYC）、TGACG-motif、CBFHV等多個(gè)潛在的與逆境有關(guān)的順式作用元件，由此推測(cè)VviCOR11基因的表達(dá)可能受ABA和低溫、干旱、高鹽等脅迫誘導(dǎo)，并且可能是CBF轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控的下游目標(biāo)基因。對(duì)VviCOR11啟動(dòng)子5'端連續(xù)缺失瞬時(shí)表達(dá)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，啟動(dòng)子在翻譯起始位點(diǎn)上游-217 bp處就表現(xiàn)了在葉片中有基礎(chǔ)表達(dá)，而且隨著啟動(dòng)子序列的延長(zhǎng)，其啟動(dòng)活性也加強(qiáng)。在非誘導(dǎo)條件下，CP5∷GUS基因在煙草的根、莖、葉、花瓣及

7、花柱中均有表達(dá)，這表明該啟動(dòng)子在各個(gè)器官中有基礎(chǔ)表達(dá)的特點(diǎn)，說明VviCOR11可能不僅參與植物逆境調(diào)控，也可能參與植物生長(zhǎng)發(fā)育等其它生命調(diào)節(jié)。
　　3我們將構(gòu)建好的pVC4215載體通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化煙草葉片，共得到27個(gè)Hyg抗性株系。經(jīng)過PCR、RT-PCR、GUS染色和Hyg PCR檢測(cè)驗(yàn)證，初步證實(shí)，VviCOR11基因已經(jīng)完整整合到7個(gè)煙草株系的基因組中。經(jīng)過生根、煉苗培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因各株系的花期提前，葉片狹長(zhǎng)。這可

8、能是因?yàn)榻M成型表達(dá)VviCOR11的轉(zhuǎn)基因煙草組織細(xì)胞液的濃度和ABA含量增加，使轉(zhuǎn)基因煙草有利于成花。4℃低溫處理20 h后，對(duì)植株進(jìn)行了快速熒光誘導(dǎo)動(dòng)力學(xué)曲線、電導(dǎo)率、MDA和脯氨酸含量等的測(cè)定，三個(gè)株系的脯氨酸含量比對(duì)照顯著增加，其它生理指標(biāo)差異不顯著。
　　4本研究通過RACE和基因組步移技術(shù)從紅豆越桔中克隆了一個(gè)DREB1基因，cDNA全長(zhǎng)887 bp，命名為VviDREB1，其DNA序列3790 bp包含了1522 b

9、p上游啟動(dòng)子序列。通過多重比對(duì)和進(jìn)化樹分析，該基因?qū)儆贒REB亞家族中的A-1組即CBF小家族成員。通過SWISS MODEL同源建模結(jié)果顯示，VviDREB1的DNA結(jié)合域(DNA-binding domain，DBD)與AtERF1的1gccA結(jié)構(gòu)相同，也包含一個(gè)三股反向平行的β-折疊片和一個(gè)α-螺旋結(jié)構(gòu)，并有結(jié)合DRE和GCC元件的潛力。洋蔥表皮亞細(xì)胞定位是在細(xì)胞核上。通過PLACE和PlantCARE在線分析軟件預(yù)測(cè)分析發(fā)現(xiàn)，V

10、viDREB1啟動(dòng)子區(qū)序列中含有許多植物激素、非生物脅迫和光等相關(guān)作用元件或轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)（Transcription factor binding locations，TFBs），其中MYCCON-SENSUSAT的CACATG基序可能是CBF表達(dá)誘導(dǎo)子ICE1(Inducer of CBF expression1)的主要結(jié)合基序。啟動(dòng)子瞬時(shí)表達(dá)實(shí)驗(yàn)表明VviDREB1在葉片中有基礎(chǔ)表達(dá)特性。定量RT-PCR結(jié)果進(jìn)一步表明，VviD

11、REB1在常態(tài)下有一定量的表達(dá)，并可以被低溫、高鹽和ABA等誘導(dǎo)，并對(duì)低溫反應(yīng)迅速，在1h時(shí)達(dá)到最高峰，是對(duì)照的7倍左右;鹽脅迫也在4h時(shí)達(dá)到最高峰，而且表達(dá)豐度是對(duì)照的17倍;ABA的最高峰雖在24h，但在0.5 h時(shí)就已超過了對(duì)照的5倍，在24 h時(shí)是對(duì)照的近15倍。
　　5為了研究VviDREB1在植物體中的異源表達(dá)特性，我們將構(gòu)建好的pVB4215載體通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化煙草，共得到25個(gè)Hyg抗性株系。經(jīng)過PCR、RT-