硫藤黃鏈霉菌中雙異腈銅載體SF2768生物合成的研究.pdf

1、硫藤黃鏈霉菌因能夠產(chǎn)生聚酮類抗生素aureothin和二硫吡咯酮類抗生素thiolutin而成為本課題組關(guān)注研究的對(duì)象?；蚪M測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)除了已經(jīng)被克隆的aureothin和thiolutin基因簇以外，該鏈霉菌還含有40多個(gè)次級(jí)代謝產(chǎn)物的生物合成基因簇，其中絕大多數(shù)還無(wú)法通過(guò)生物信息學(xué)分析找到其對(duì)應(yīng)的產(chǎn)物。前期研究發(fā)現(xiàn)含有其中一個(gè)新型NRPS類生物合成基因簇的克隆pZMY13-2eut可在變鉛青鏈霉菌ZX1中異源表達(dá)產(chǎn)生具有廣譜性抑菌

2、活性的物質(zhì)。
　　本研究從異源表達(dá)菌株S.lividans∷pZMY13-2cut大規(guī)模發(fā)酵的產(chǎn)物中，分離純化到這個(gè)活性物質(zhì)，并利用質(zhì)譜及核磁共振分析解析出其化學(xué)結(jié)構(gòu)，證明這個(gè)NRPS基因簇(sfa基因簇)所合成的活性產(chǎn)物為雙異腈化合物SF2768。在基因簇功能的研究中，通過(guò)生物活性測(cè)定及高分辨率液相質(zhì)譜聯(lián)用分析技術(shù)檢測(cè)了sfa基因簇中各個(gè)基因缺失突變菌株的發(fā)酵產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)sfaA、sfaB、sfaC、faD和sfaE這五個(gè)基因的敲

3、除會(huì)完全阻斷抗生素SF2768的合成。并且在基因缺失突變菌株ΔsfaE的發(fā)酵產(chǎn)物中分離到2個(gè)新結(jié)構(gòu)的異腈化合物3和4。它們與SF2768具有相似的結(jié)構(gòu)，是其生物合成途徑中的中間產(chǎn)物和副產(chǎn)物。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)非核糖體多肽合成酶SfaD中A結(jié)構(gòu)域的最適底物為賴氨酸。綜合基因功能研究的結(jié)果，結(jié)合生物信息學(xué)的分析，利用產(chǎn)物SF2768及其中間產(chǎn)物和副產(chǎn)物3和4的化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行反向遺傳學(xué)的推理，基本闡明了抗生素SF2768的生物合成途徑。
　　S

4、F2768的生物合成基因簇與來(lái)自粘細(xì)菌的鄰苯二酚型鐵載體myxochelins的生物合成基因簇同源，暗示著SF2768可能具有金屬載體的功能。生物信息學(xué)比對(duì)發(fā)現(xiàn)sfa生物合成基因簇中存在一個(gè)疑似的與鐵離子攝入相關(guān)的ATP-bing cassette(ABC)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，這一結(jié)果暗示其產(chǎn)物可能是鐵載體。然而隨后的高分辨質(zhì)譜檢測(cè)(HR-ESI-MS)、RP-TLC、CAS顯色和滴定實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)化合物SF2768不能與Fe3+發(fā)生相互作用，而是特異

5、性的結(jié)合Cu2+形成復(fù)合物。進(jìn)一步的電感耦合等離子體質(zhì)譜(ICP-MS)分析的結(jié)果證實(shí)SF2768可以將銅離子通過(guò)復(fù)合物的形式運(yùn)入鏈霉菌細(xì)胞內(nèi)，說(shuō)明SF2768具有銅離子載體(chalkophore)的生理功能。通過(guò)比較S.lividans∷pZMY13-2cut和突變菌株Δorf12胞外與胞內(nèi)SF2768含量的比值證實(shí)MFS家族蛋白Orf12負(fù)責(zé)外排SF2768。通過(guò)ICP-MS檢測(cè)S.lividans∷pZMY13-2cut和突變株

6、Δorf19-21攝入65Cu-SF2768復(fù)合物的能力，證實(shí)ABC超家族轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Orf19-21可以以復(fù)合物形式將銅離子轉(zhuǎn)運(yùn)到鏈霉菌細(xì)胞內(nèi)。以上結(jié)果初步闡明了SF2768的外排及攝入機(jī)制，為合理解釋SF2768的運(yùn)輸模式奠定了基礎(chǔ)。
　　除此之外，我們還發(fā)現(xiàn)在生物活性測(cè)定中添加銅離子可以抵消SF2768的抑制作用。分析其原因，可能有兩點(diǎn):1）化合物SF2768螯合了培養(yǎng)基中的銅離子形成復(fù)合物，而指示菌B.subtilis168無(wú)