灰藤黃鏈霉菌P510中吩嗪類抗生物質(zhì)的純化鑒定及發(fā)酵優(yōu)化.pdf

1、灰藤黃鏈霉菌P510（Streptomyces griseoluteus P510）是本實(shí)驗(yàn)室從土壤中分離得到的，前期研究發(fā)現(xiàn)其胞外產(chǎn)物中含有吩嗪類活性物質(zhì)灰藤黃菌酸（griseolutein acid，GA）。但是，在GA的純化過程中，發(fā)現(xiàn)S. gri-seoluteus P510的胞外產(chǎn)物中還有其它活性組分，同時(shí)發(fā)現(xiàn)P510的胞內(nèi)產(chǎn)物也具有一定的生物活性。因此，本論文對S. griseoluteus P510發(fā)酵產(chǎn)物中的其它活性組分

2、了進(jìn)行了分離純化和結(jié)構(gòu)鑒定，同時(shí)初步研究了發(fā)酵培養(yǎng)基對這些組分合成的影響。
　　首先，以抑菌活性、產(chǎn)物顏色及光吸收波長等吩嗪類物質(zhì)的特性作參考，對S. griseoluteus P510的代謝產(chǎn)物進(jìn)行了分離純化和結(jié)構(gòu)鑒定。通過將S. griseoluteus P510發(fā)酵液經(jīng)過等體積的酸性乙酸乙酯萃取，流動相為甲醇-氯仿（1:9）的常壓硅膠柱層析及制備型薄層層析，流動相為甲醇-0.1％乙酸水（55:45）的C18反相高效液相層析，

3、最終從10 L發(fā)酵液中純化得到3.2 mg的純物質(zhì)A及9.1 mg的GA。同時(shí)，S. griseoluteus P510菌絲體經(jīng)過丙酮萃取，流動相為甲醇-0.1%乙酸水（55:45）的C18反相高效液相層析，最終從20.1 g菌絲體中純化得到6.5 mg的純物質(zhì)IX。通過全波長掃描、ESI-MS及UPLC-MS-MS、1H-NMR波譜技術(shù)，并結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)，鑒定物質(zhì)A的結(jié)構(gòu)為吩嗪-1-羧酸(phenazine-1-carboxylic a

4、cid, PCA)，物質(zhì)IX的結(jié)構(gòu)為1-羥基吩嗪(1-hydroxyphenazine,1-OH-PHZ)
　　其次，考察了GA、PCA和1-OH-PHZ對西瓜枯萎病菌、小麥赤霉病菌、水稻稻瘟菌、甜葉菊斑枯病菌、番茄早疫病菌和油菜菌核病原菌這六種植物病原真菌的抑菌活性。結(jié)果表明三種產(chǎn)物都具有明顯的抑菌活性，并且對西瓜枯萎病具有最高抑菌活性，PCA、GA和1-OH-PHZ對其最小抑菌濃度分別為<1μg/mL、2μg/mL和2μg/m

5、L。
　　最后，考察了培養(yǎng)基中碳源種類（8g/L的葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉和甘油）、氮源種類（2 g/L的硫酸銨、黃豆餅粉、蛋白胨和酵母提取物）、碳/氮比（葡萄糖-酵母提取物4:1、1:1和1:4）以及無機(jī)鹽種類（0.5g/L的MgCl2·6H2O、FeSO4·7H2O、ZnSO4·7H2O和MnSO4·H2O）對S. gri-seoluteus P510發(fā)酵時(shí)三種吩嗪類代謝產(chǎn)物合成的影響。結(jié)果表明葡萄糖、酵母提取物和MgCl2有

6、利于GA和PCA的合成，而甘油、黃豆餅粉和MgCl2有利于1-OH-PHZ的合成；碳/氮比為1:1有利于GA和1-OH-PHZ的合成，碳/氮比為4:1有利于PCA的合成。以產(chǎn)量最高的GA為例，采用5 g/L的葡萄糖、5g/L的酵母提取物和0.5g/L的MgCl2·6H2O為培養(yǎng)基，培養(yǎng)96小時(shí)后，GA的最高產(chǎn)量達(dá)到了146.4±3.6mg/L，比優(yōu)化前的酵母-淀粉II培養(yǎng)基（可溶性淀粉8g/L，酵母提取物2 g/L）中的產(chǎn)量提高了約5.