鏈霉菌P510中吩嗪類抗生物質(zhì)的分離純化.pdf

1、吩嗪類化合物由于其結(jié)構(gòu)和活性的多樣性,成為一類極有價(jià)值的生防抗生素,而鏈霉菌則是天然吩嗪類化合物的重要來源。鏈霉菌P510是從根際土壤中分離得到的生防菌株,通過16S rDNA序列比較以及平板培養(yǎng)特性的研究,確定該菌屬于灰藤黃鏈霉菌(Streptomyces griseoluteus)。相關(guān)文獻(xiàn)顯示灰藤黃鏈霉菌能夠產(chǎn)多種吩嗪類活性代謝產(chǎn)物。本論文首先從合成基因和產(chǎn)物活性出發(fā),研究了鏈霉菌P510生物合成吩嗪類化合物的可能性。通過PCR的

2、方法,在該菌株的基因序列中擴(kuò)增得到3kb的部分吩嗪合成基因,與已報(bào)道的鏈霉菌DSM1042中的吩嗪合成基因ephzC、ephzD和ephzE以及假單胞菌PAO1中的吩嗪合成基因phzC、phzD和phzE相似度達(dá)71-74％,從基因水平論證了該菌株具有合成吩嗪類代謝產(chǎn)物的可能性;通過產(chǎn)物活性分析,發(fā)現(xiàn)該菌株的胞外代謝產(chǎn)物中具有能夠抑制枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌等細(xì)菌以及油菜菌核病原菌、水稻紋枯病病原菌、終極腐霉、甜葉菊斑枯病病原菌等真

3、菌的活性物質(zhì),符合吩嗪類物質(zhì)廣譜抑菌的特點(diǎn)。以抑菌活性、顏色、光吸收波長等吩嗪類物質(zhì)的特性作參考,對鏈霉菌P510的胞外代謝產(chǎn)物進(jìn)行了分離純化和結(jié)構(gòu)鑒定。首先,考察了萃取劑的種類和pH值,確定了以pH2.0的乙酸乙酯為萃取劑,按照1:1的體積比對發(fā)酵液進(jìn)行萃取,從10L發(fā)酵液中共得到橙紅色的活性粗提物0.5 g。其次,通過硅膠薄層層析展開劑的優(yōu)化,確定了以乙酸乙酯作為流動相,經(jīng)過25cm×1cm(直徑)的常壓硅膠柱層析,從0.5g的粗提

4、物中初步純化得到了具有抑菌作用的活性組分Ⅱ(116.2mg)和Ⅴ(71.4mg)。最后,通過C18反相制備型HPLC,以50%的甲醇作為流動相進(jìn)一步精制,從活性組分Ⅴ中得到了具有抑菌活性的純物質(zhì)C(8 mg)。該物質(zhì)通過面積歸一化法計(jì)算在265nm波長下的純度為95.92%。經(jīng)LC-MS分析該物質(zhì)的分子量為284.0682;結(jié)合1H NMR初步確定物質(zhì)C為具有吩嗪環(huán)的灰藤黃菌酸。另外,同樣通過制備型HPLC的精制,從116.2mg的活性

5、組分Ⅱ中得到了具有抑菌活性的純物質(zhì)A(2mg)和積累較多的純物質(zhì)B(13.7mg),其中物質(zhì)B經(jīng)LC-MS和1H NMR確定為對羥基苯甲醛。為了提高灰藤黃菌酸的產(chǎn)量,對鏈霉菌P510的培養(yǎng)條件進(jìn)行了初步優(yōu)化。通過培養(yǎng)環(huán)境、碳/氮源種類以及碳/氮比的優(yōu)化,以葡萄糖2g/L、酵母提取物8g/L為培養(yǎng)基組成,在裝液量為50 mL的250mL搖瓶中同時(shí)添加10g的玻璃小珠,對鏈霉菌P510培養(yǎng)96小時(shí)后,其灰藤黃菌酸的產(chǎn)量達(dá)到了49.72±4.