水牛繁殖和泌乳性狀候選基因篩選及IGFBP7基因功能解析.pdf

1、我國(guó)水牛種質(zhì)資源豐富，既有沼澤型，又有河流型，主要用于耕地和產(chǎn)肉。近年來(lái)，隨著水牛向乳用方向改良，奶水牛產(chǎn)業(yè)得到快速發(fā)展。水牛奶營(yíng)養(yǎng)豐富全面、消化吸收率高，將水牛奶深加工成乳制品，如“乳豆腐”、“奶餅”、“雙皮奶”等，深受消費(fèi)者喜愛(ài)，具有廣闊的市場(chǎng)前景。然而，盡管我國(guó)水牛存欄量多，但水牛產(chǎn)奶量和繁殖力低，目前為止還沒(méi)有專門的乳用型水牛品種，從而影響奶水牛產(chǎn)業(yè)的進(jìn)一步發(fā)展。
　　水牛的繁殖性狀和泌乳性狀均是重要的經(jīng)濟(jì)性狀，為典型的數(shù)

2、量性狀。由于遺傳力低和影響因素多，通過(guò)傳統(tǒng)方法選育高繁殖力和高產(chǎn)奶量奶水牛進(jìn)展緩慢。目前，全基因組關(guān)聯(lián)分析和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序?qū)ρ芯繑?shù)量性狀提供了新的方向。因此，本研究利用全基因組關(guān)聯(lián)分析和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序方法對(duì)影響水牛繁殖性能和產(chǎn)奶性能的候選基因進(jìn)行篩選與鑒定。本研究的目的旨在揭示奶水牛泌乳性能和繁殖性能的分子遺傳基礎(chǔ)，為提高奶水牛的產(chǎn)奶性能和繁殖性能以及遺傳改良提供理論基礎(chǔ)。
　　1水牛繁殖性狀候選基因分析
　　本試驗(yàn)分為三個(gè)部分。首

3、先利用商業(yè)化水牛90K基因芯片(Affymetrix Axiom(@))對(duì)462頭意大利地中海水牛的頭胎產(chǎn)犢日齡、第二胎產(chǎn)犢日齡、第三胎產(chǎn)犢日齡、受精所需輸精次數(shù)、空懷天數(shù)、產(chǎn)犢間隔6個(gè)繁殖性狀進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析。繁殖性狀原始數(shù)據(jù)來(lái)自于意大利水牛育種評(píng)估中心。通過(guò)GWAS分析尋找影響水牛繁殖性狀的SNP、基因組區(qū)域和候選基因。其次利用二代測(cè)序技術(shù)對(duì)四個(gè)時(shí)期(卵泡直徑＜5mm，5～8mm，8～12mm和＞12mm)的水牛有腔卵泡顆粒細(xì)胞

4、進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，并進(jìn)行定性和定量分析。根據(jù)GO和KEGG富集分析，尋找影響卵泡發(fā)育的候選基因。最后通過(guò)整合GWAS結(jié)果和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果，鑒別影響水牛繁殖性能的關(guān)鍵候選基因，并利用RNAi技術(shù)對(duì)候選基因IGFBP7在水牛顆粒細(xì)胞中進(jìn)行驗(yàn)證。主要結(jié)果如下:
　　(1)全基因組關(guān)聯(lián)分析鑒別到與繁殖性狀相關(guān)的40個(gè)SNP和28個(gè)候選基因。
　　(2)單倍型分析發(fā)現(xiàn)在5號(hào)染色體的2.3～2.7Mb區(qū)域存在一個(gè)與水牛繁殖性能相關(guān)的QTL

5、區(qū)，其中多個(gè)SNP主要位于TRHDE基因內(nèi)和附近的序列上。
　　(3)對(duì)水牛卵泡顆粒細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組分析鑒別出17700個(gè)基因，其中1076個(gè)基因在卵泡發(fā)育的不同時(shí)期差異表達(dá)顯著，30個(gè)基因在卵泡發(fā)育的四個(gè)時(shí)期有差異表達(dá)。差異表達(dá)基因數(shù)最多的是卵泡發(fā)育的最后兩個(gè)時(shí)期。
　　(4)差異表達(dá)基因在卵泡發(fā)育末期主要富集在免疫相關(guān)信號(hào)通路，提示該時(shí)期卵泡為排卵做準(zhǔn)備。
　　(5)整合GWAS分析結(jié)果和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果，發(fā)現(xiàn)與繁殖性狀

6、相關(guān)的28個(gè)候選基因中有25個(gè)基因在卵泡發(fā)育不同時(shí)期有表達(dá)，提示這些基因可能直接參與水牛卵泡發(fā)育的調(diào)控，從而影響水牛繁殖性能。
　　(6)IGFBP7基因在卵泡發(fā)育的4個(gè)階段均有較高的表達(dá)量。水牛顆粒細(xì)胞用RNAi敲低IGFBP7后，增值和凋亡以及雌激素和孕激素的分泌均發(fā)生顯著的變化。
　　2水牛泌乳性狀候選基因分析
　　本試驗(yàn)分為兩個(gè)部分。首先對(duì)1002頭水牛的16個(gè)體型外貌指標(biāo)與產(chǎn)奶量進(jìn)行回歸分析，篩選出與產(chǎn)奶量顯

7、著相關(guān)的體型外貌指標(biāo)，并用地中海水牛群體對(duì)該指標(biāo)進(jìn)行驗(yàn)證。其次，根據(jù)獲得的體型外貌指標(biāo)，利用90K Affymetrix Axiom(@)Buffalo SNP Array對(duì)176頭意大利地中海水牛進(jìn)行基因分型，質(zhì)控后，分別與關(guān)鍵體型外貌指標(biāo)進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析，尋找與體型外貌指標(biāo)相關(guān)的SNP、候選基因和QTL。主要結(jié)果如下:
　　(1)通過(guò)體型外貌指標(biāo)與泌乳量的分析，發(fā)現(xiàn)乳房性狀與產(chǎn)奶量顯著相關(guān)，乳房性狀可做為水牛產(chǎn)奶量的直接或

8、間接指標(biāo)。
　　(2)對(duì)水牛前乳頭長(zhǎng)、后乳頭長(zhǎng)、前乳頭間距、后乳頭間距和前后乳距5個(gè)乳房性狀的全基因組關(guān)聯(lián)分析，共獲得10個(gè)與乳房性狀相關(guān)的SNP和5個(gè)候選基因，分別是PTPN11、ZNF385B、LRP2、COX18和DTHD1。
　　(3)單倍型分析發(fā)現(xiàn)一個(gè)位于候選基因LRP2內(nèi)的QTL顯著影響水牛的乳房性狀。對(duì)LRP2進(jìn)行表達(dá)譜分析，發(fā)現(xiàn)LRP2在乳腺組織中高表達(dá)，推測(cè)該基因可能參與調(diào)控乳腺的發(fā)育以及在泌乳調(diào)控過(guò)程中參