NADH再生系統(tǒng)的共建及石油降解酶制劑的制備.pdf

1、在石油的開采、存儲(chǔ)、精煉以及之后的使用過(guò)程中不可避免的會(huì)產(chǎn)生一些泄漏和排放，從而對(duì)環(huán)境造成很大的破壞，導(dǎo)致土壤和地下水的嚴(yán)重污染，此外，這些污染對(duì)生物也同樣具有很大的毒性。利用自然界中的微生物的代謝過(guò)程對(duì)石油烴的降解是目前來(lái)說(shuō)最為有效的修復(fù)方式。而生物降解的本質(zhì)是生物體內(nèi)降解酶對(duì)石油烴分子的酶促降解，將微生物的細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞破碎，從中提取石油烴降解酶，直接應(yīng)用于石油烴的降解，可以避開石油烴分子從胞外到胞內(nèi)的運(yùn)輸過(guò)程，提高石油烴的降解效率。

2、
　　本文通過(guò)表達(dá)來(lái)自博伊丁假絲酵母菌中的甲酸脫氫酶（NADH再生系統(tǒng)）并與石油降解酶進(jìn)行共固定，構(gòu)建石油降解及NADH再生的偶聯(lián)系統(tǒng)，利用甲酸/甲酸脫氫酶輔酶再生系統(tǒng)可以為石油烴降解酶連續(xù)提供還原態(tài)NADH，實(shí)現(xiàn)石油酶降解及NADH再生的偶聯(lián)，降低石油烴降解酶的使用成本；研究該系統(tǒng)的構(gòu)建及石油降解特性，主要研究?jī)?nèi)容及結(jié)論如下：
　?。?）首先提取了博伊丁假絲酵母菌（C.boidinii）的基因組，PCR擴(kuò)增了NAD+依賴性

3、的甲酸脫氫酶的基因（fdh），并對(duì)博伊丁假絲酵母菌的fdh基因進(jìn)行了序列分析；
　?。?）將fdh基因連接到載體pET28a(+)中，構(gòu)建了質(zhì)粒pET28a(+)-fdh，轉(zhuǎn)化大腸桿菌 BL21(DE3)，構(gòu)建完成表達(dá) fdh的大腸桿菌菌株 E.coli E.coli BL21（pET28a(+)-fdh）。
　?。?）培養(yǎng)E.coli BL21（pET28a(+)-fdh），轉(zhuǎn)接2h之后進(jìn)行誘導(dǎo)，添加終濃度為1 mmol/

4、L的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，離心收集菌體、破碎，測(cè)定酶活性，結(jié)果顯示當(dāng)破碎功率為300W、破碎\間隔時(shí)間為2s\2s、工作總時(shí)間10min時(shí)，每克菌體得到的酶活性為1.19U；
　?。?）將石油降解酶與FDH進(jìn)行共固定，在每克硅藻土固定2mg石油降解酶的情況下，當(dāng)甲酸脫氫酶的添加量為0.06 U·g-1時(shí)，固定化酶的催化活性最高；
　　（5）將石油降解酶與 FDH進(jìn)行共固定。當(dāng)石油降解酶2mg、甲酸脫氫酶0.06 U、甲酸鈉0.1