pGAP調(diào)控下的內(nèi)切纖維素酶組成型表達(dá)及酶制劑的制備.pdf

1、畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)是一種利用甲醇為唯一碳源和能源，高水平表達(dá)外源蛋白的真核表達(dá)系統(tǒng)。甲醇有毒，且易燃、易爆，在大規(guī)模生產(chǎn)過(guò)程中很不安全，而且發(fā)酵產(chǎn)物中易有殘留，這對(duì)畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)在工業(yè)、食品等方面上的應(yīng)用產(chǎn)生一定影響。
　　源于三磷酸甘油醛脫氫酶啟動(dòng)子(pGAP)調(diào)控的組成型表達(dá)系統(tǒng)在表達(dá)目的蛋白時(shí)，可在同一碳源（葡萄糖、甘油、油酸或甲醇等）中連續(xù)培養(yǎng)，適宜的條件下其組成型表達(dá)也可以達(dá)到很高的水平，因此利用三磷酸甘油醛脫氫酶啟動(dòng)子

2、替換醇氧化酶啟動(dòng)子的技術(shù)成為近年研究的熱點(diǎn)。
　　纖維素酶作為一種可以分解纖維素的催化劑，在食品工業(yè)、環(huán)境保護(hù)等方面應(yīng)用十分廣泛。近幾年利用基因克隆及表達(dá)調(diào)控等技術(shù)獲得活性更高、適用范圍更廣的纖維素酶的基礎(chǔ)研究越來(lái)越深入，并且均取得顯著進(jìn)展。隨著酶制劑工業(yè)的發(fā)展，一些大規(guī)模生產(chǎn)的微生物酶制劑多傾向采用液態(tài)酶制劑，但是液態(tài)酶不穩(wěn)定，易失活，工業(yè)上經(jīng)常采用添加穩(wěn)定劑和防腐劑的方法來(lái)保持液態(tài)酶的儲(chǔ)存穩(wěn)定性。因此針對(duì)纖維素酶熱穩(wěn)定性差的問(wèn)

3、題，篩選并優(yōu)化出液態(tài)纖維素酶酶制劑的復(fù)合穩(wěn)定劑具有非常重要的應(yīng)用價(jià)值。
　　本研究利用基因克隆技術(shù)，從畢赤酵母基因組DNA中擴(kuò)增GAP啟動(dòng)子，替換酵母表達(dá)載體pPIC9K上的AOX啟動(dòng)子，構(gòu)建組成型表達(dá)載體pPIC9K-gap，先利用報(bào)告基因GUS驗(yàn)證其可行性，再將內(nèi)切纖維素酶eg替換報(bào)告基因GUS，構(gòu)建組成型表達(dá)eg的重組載體pPIC9K-gap-eg，通過(guò)篩選最終得到在甘油誘導(dǎo)條件下即可分泌內(nèi)切纖維素酶的組成型畢赤酵母菌株P(guān)P

4、GAP-eg4，其酶活為19 U/mL，相對(duì)于酶活為16 U/mL的誘導(dǎo)型畢赤酵母GS115(pPIC9K-eg)，兩者酶活相差不大。
　　對(duì)組成型畢赤酵母菌株P(guān)PGAP-eg4的產(chǎn)酶發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)當(dāng)接菌量為0.5％，且在甘油為唯一碳源、添加量是0.5％的條件下連續(xù)誘導(dǎo)到第7天，菌株酶活最大，達(dá)到40 U/mL，是初始發(fā)酵條件下酶活力的2.2倍。
　　為了提高內(nèi)切纖維素酶的儲(chǔ)存穩(wěn)定性，本試驗(yàn)選擇添加各種穩(wěn)定劑，即在液

5、態(tài)酶制劑中添加多元醇類、糖類、金屬離子以及蛋白質(zhì)等物質(zhì)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，半乳糖、糊精、明膠對(duì)酶的穩(wěn)定性影響較大，因此，對(duì)半乳糖、糊精、明膠三個(gè)因素分別取三水平進(jìn)行正交試驗(yàn)。最終利用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)確定了其最佳復(fù)合穩(wěn)定劑的配比為:半乳糖4％、明膠1％、糊精8％。在該復(fù)合穩(wěn)定劑作用下，65℃保溫2h后，酶活保留率達(dá)250.67％，顯著提高了內(nèi)切纖維素酶的熱穩(wěn)定性。
　　為進(jìn)一步確定復(fù)合穩(wěn)定劑對(duì)液態(tài)酶制劑儲(chǔ)存穩(wěn)定性的影響，探討了當(dāng)穩(wěn)定劑濃