血管緊張素Ⅱ調(diào)節(jié)胸腺FoxN1參與高血壓進(jìn)程的機(jī)制研究.pdf

1、目的:高血壓是一種多因素疾病，多種細(xì)胞或者細(xì)胞因子等都參與其發(fā)病進(jìn)程。隨著人口老齡化和生活方式的改變，高血壓的發(fā)病率呈現(xiàn)增高的嚴(yán)峻態(tài)勢(shì)，高血壓已然成為全球性的重要公共衛(wèi)生問(wèn)題。由高血壓帶來(lái)的各種心腦血管疾病以及其相關(guān)的并發(fā)癥則成為嚴(yán)重威脅世界人民群眾身心健康，臨床迫切需要解決的關(guān)鍵問(wèn)題。既往研究已知炎癥反應(yīng)和免疫系統(tǒng)參與了高血壓進(jìn)程，而且已經(jīng)得到的廣泛認(rèn)可。血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)是一種導(dǎo)致高血壓和靶器官損害的主要介質(zhì)和血管活性肽。另外

2、，通過(guò)以往研究我們也已經(jīng)明確，T淋巴細(xì)胞參與了炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)，并在高血壓的病理進(jìn)程中具有重要的調(diào)節(jié)作用。而胸腺作為一個(gè)十分重要的免疫器官，以及T細(xì)胞發(fā)育成熟的重要位點(diǎn)，雖然隨著年齡增長(zhǎng)，胸腺功能逐漸減退，但其依然具有一定的生理功能，可以繼續(xù)促進(jìn)新的T細(xì)胞的產(chǎn)生，尤其近來(lái)國(guó)內(nèi)外很多研究揭示:通過(guò)調(diào)節(jié)相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子FoxN1逆轉(zhuǎn)胸腺衰老可奇跡般逆轉(zhuǎn)小鼠的整體衰老，有牽一發(fā)而動(dòng)全身的功效，這就激發(fā)了研究人員的無(wú)限遐想。
　　既往有研究

3、結(jié)果顯示，高血壓小鼠可能存在胸腺功能減退的情況。說(shuō)明胸腺與高血壓進(jìn)展可能存在密切相關(guān)性，那么高血壓本身的病理進(jìn)程是否會(huì)導(dǎo)致胸腺功能減退加速衰老，以及其可能的相關(guān)的機(jī)制都不清楚，而通過(guò)逆轉(zhuǎn)胸腺衰老則是否能夠影響高血壓進(jìn)程亦尚不清楚。本研究通過(guò)血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)小鼠高血壓模型，觀察高血壓小鼠胸腺功能的改變，隨后通過(guò)胸腺移植等技術(shù)進(jìn)行干預(yù)，觀察上述操作對(duì)高血壓進(jìn)程及其靶器官的影響，并通過(guò)體外培養(yǎng)胸腺上皮細(xì)胞(TEC)探討其中可能存在的機(jī)制，從而

4、為臨床治療高血壓提供新的診療方案和治療靶點(diǎn)。
　　方法:本研究動(dòng)物實(shí)驗(yàn)共分為兩個(gè)大部分，第一部分在體實(shí)驗(yàn)，將45只8周齡的C57BL/6J雄性小鼠，隨機(jī)分為正常對(duì)照組（Con組，n=15）、假手術(shù)組（Sham組，n=15）和AngⅡ誘導(dǎo)的高血壓模型組(HTN組，n=15)。高血壓模型組采用皮下植入裝有AngⅡ溶液的微泵誘導(dǎo)而成，植入微泵后第三天開(kāi)始每天早上8:00-9:00之間不間斷的進(jìn)行鼠尾無(wú)創(chuàng)測(cè)壓，持續(xù)8周記錄血壓數(shù)據(jù)，處死小

5、鼠，并留取小鼠血樣、胸腺、脾臟、心臟和腎臟等器官或組織。第二部分分為在體實(shí)驗(yàn)和體外實(shí)驗(yàn)，其中在體實(shí)驗(yàn):45只8周齡的C57BL/6J雄性小鼠，先被隨機(jī)分為兩組，正常對(duì)照組（Con組，n=15）和AngⅡ誘導(dǎo)的高血壓模型組(n=30)。連續(xù)鼠尾無(wú)創(chuàng)測(cè)壓4周后，明確建模成功后再將高血壓模型組隨機(jī)分為高血壓組（HTN組，n=15）和移植組(HTN+Trans組，n=15)。分離出生12-24h的C57BL/6J乳鼠胸腺組織，將其切成小塊移植至

6、移植組小鼠另外一側(cè)（與植入微泵相反一側(cè)）的腎包膜下，移植后3天繼續(xù)每天早上8:00-9:00之間不間斷的進(jìn)行鼠尾無(wú)創(chuàng)測(cè)壓，持續(xù)5周記錄血壓數(shù)據(jù)，并應(yīng)用心臟超聲檢測(cè)小鼠心臟功能，然后處死小鼠，并留取小鼠血樣、胸腺、心臟、脾臟和腎臟等器官或組織。流式細(xì)胞儀分析外周血和脾臟T細(xì)胞亞群的百分比，以及胸腺細(xì)胞皮質(zhì)胸腺上皮細(xì)胞(cTEC)和髓質(zhì)胸腺上皮細(xì)胞(mTEC)比值(cTEC/mTEC);實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)胸腺FoxN1、Aire、sjTRE

7、C和ATRAP表達(dá)水平;WesternBlot檢測(cè)小鼠胸腺FoxN1、Aire和ATRAP的蛋白水平;以及對(duì)胸腺、脾臟、心臟和腎臟組織進(jìn)行HE染色，并通過(guò)免疫組化方式檢測(cè)胸腺FoxN1的水平;體外試驗(yàn):將出生12-24h的C57BL/6J乳鼠胸腺在無(wú)菌條件下取出，然后進(jìn)行胸腺上皮細(xì)胞(TEC)的培養(yǎng)，胸腺上皮細(xì)胞被分為空白對(duì)照組（即無(wú)刺激）、AngⅡ刺激48h組和AngⅡ刺激48h后與無(wú)刺激的TEC共培養(yǎng)組，然后取樣以提取RNA和蛋白，

8、檢測(cè)FoxN1和ATRAP mRNA表達(dá)水平和蛋白水平。
　　結(jié)果:
　　1、HTN組收縮壓(SBP)與舒張壓(DBP)明顯高于Con組和Sham組(p＜0.05)，Con組與Sham組血壓沒(méi)有差異，HTN+Trans組血壓低于HTN組(p＜0.05)略高于Con組(p＞0.05)。在第一部分小鼠在體實(shí)驗(yàn)中，HTN組小鼠胸腺指數(shù)低于Con組和Sham組(p＜0.05)，Con組和Sham組無(wú)差異;在第二部分小鼠在體實(shí)驗(yàn)中，與

9、Con組比較，HTN組小鼠胸腺指數(shù)明顯下降(p＜0.01)，脾臟指數(shù)和腎臟指數(shù)升高(p＜0.05)，左室心臟比明顯升高(p＜0.01);與HTN組比較，HTN+Trans組小鼠胸腺指數(shù)明顯升高(p＜0.01)，脾臟指數(shù)、腎臟指數(shù)和左室心臟比下降(p＜0.05)i;HTN+Trans組小鼠左室心臟比高于Con組(p＜0.05)。
　　2、與Con組比較，HTN組LVEF、FS和SV均下降(p＜0.05)，ESV升高(p＜0.05);

10、HTN+Trans組LVEF、FS和SV高于HTN組，ESV低于HTN組(p＜0.05)，與Con組無(wú)差異。
　　3、在第一部分中，與Con組小鼠相比較，HTN組小鼠胸腺衰老相關(guān)基因FoxN1和Aire的表達(dá)下調(diào)(P＜0.05)，HTN組小鼠sjTREC的含量亦下降(p＜0.05)，其余各組無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。在第二部分中，與Con組和HTN+Trans組比較，HTN組胸腺FoxN1、Aire、ATRAP和Thymosin beta

11、4的表達(dá)下調(diào)(p＜0.05)，HTN組胸腺sjTREC的含量也減少(p＜0.05)，然而HTN組脾臟sjTREC的含量增加(p＜0.05)，余無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　4、流式分析結(jié)果顯示，第一部分中HTN組小鼠外周血和脾臟TEM明顯高于Con組和Sham組(p＜0.05)，HTN組小鼠脾臟na(i)ve T細(xì)胞低于Con組和Sham組(p＜0.05)，余無(wú)差異。第二部分中HTN組小鼠外周血和脾臟組織TEM明顯高于Con組和HTN+Tr

12、ans組(p＜0.05)，HTN組小鼠外周血na(i)veT細(xì)胞低于Con組和HTN+Trans組(p＜0.05)，HTN組小鼠cTEC/mTEC比值高于Con組，低于HTN+Trans組(p＜0.05)。
　　5、與Con組和HTN+Trans組比較，HTN組胸腺FoxN1和Aire，以及ATRAP的蛋白表達(dá)水平明顯下調(diào)(p＜0.01)，其中與Con組比較，HTN+Trans組FoxN1的蛋白水平下降(p＜0.05)，余無(wú)差異。

13、
　　6、胸腺HE染色，結(jié)果顯示，各組小鼠胸腺均出現(xiàn)不同程度的典型退化萎縮表現(xiàn)，其中高血壓組小鼠出現(xiàn)胸腺上皮間室的典型退化萎縮最為嚴(yán)重，皮質(zhì)和髓質(zhì)區(qū)域之間的區(qū)別減少以及胸腺小島數(shù)量減少，而高血壓移植組，胸腺病理與正常對(duì)照組差異較小，胸腺退化程度較輕。腎臟HE染色，顯示高血壓組小鼠可見(jiàn)病變區(qū)域與正常組織區(qū)域界限明顯，部分區(qū)域腎小管萎縮及間質(zhì)發(fā)生纖維化，及以淋巴細(xì)胞及漿細(xì)胞為主的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn);部分血管可見(jiàn)蛋白栓塞，個(gè)別腎小球萎縮，囊腔

14、擴(kuò)張，囊壁明顯增厚。脾臟HE染色，顯示Con組小鼠脾組織整體結(jié)構(gòu)輕度異常，脾小結(jié)數(shù)量無(wú)輕度減少，個(gè)別脾小結(jié)萎縮，淋巴數(shù)量下降，小部分區(qū)域紅髓白髓界限不清，但仍可見(jiàn)脾動(dòng)脈，脾組織內(nèi)可見(jiàn)大量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn);HTN組小鼠脾組織整體結(jié)構(gòu)異常，組、織大部分區(qū)域結(jié)構(gòu)紊亂，無(wú)正常脾小結(jié)結(jié)構(gòu)，紅髓白髓界限不清，可見(jiàn)多核巨噬細(xì)胞及中性粒細(xì)胞增多;HTN+Trans組小鼠脾組織整體結(jié)構(gòu)異常，但與高血壓組比較相對(duì)較輕，脾小結(jié)數(shù)量減少，且部分區(qū)域脾小結(jié)萎縮;部

15、分區(qū)域紅髓白髓界限不清，組織無(wú)明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，淋巴數(shù)量減少。心臟HE染色，顯示高血壓組心肌肥厚，左室肥厚指數(shù)和左心室壁厚度增大以及纖維化增多等;HTN組主動(dòng)脈壁增厚(p＜0.05)，Con組和HTN+Trans組之間無(wú)差異。
　　7、免疫組化HTN組胸腺皮質(zhì)和髓質(zhì)區(qū)域之間的區(qū)別減少，F(xiàn)oxN1染色減少，HTN組小鼠胸腺FoxN1熒光累計(jì)光密度值明顯下降(p＜0.01)，HTN+Trans組明顯改善。
　　8、體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯

16、示，與無(wú)刺激的blank組、給予AngⅡ刺激和給予AngⅡ刺激后共培養(yǎng)組比較，給予1μmol/L的血管緊張素Ⅱ刺激后，F(xiàn)oxN1和ATRAP的mRNA表達(dá)水平以及其蛋白水平均下調(diào)(p＜0.05)，給予AngⅡ刺激后在共培養(yǎng)一段時(shí)間后的Co-culture組，與blank組無(wú)差異。
　　結(jié)論:體外實(shí)驗(yàn)表明血管緊張素Ⅱ可以通過(guò)下調(diào)ATRAP的表達(dá)，進(jìn)而下調(diào)胸腺FoxN1的表達(dá)，導(dǎo)致胸腺功能減退，共培養(yǎng)可改善其影響。在體實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示An

17、gⅡ誘導(dǎo)的高血壓小鼠存在胸腺功能減退，包括FoxN1、Aire和ATRAP的mRNA表達(dá)的下調(diào)和蛋白水平的下降，以及反映胸腺近期輸出功能減弱的sjTREC含量的下降，T細(xì)胞亞群百分比的失衡和胸腺素β4的下調(diào)，從而導(dǎo)致或者加重高血壓進(jìn)程。通過(guò)胸腺移植，提高胸腺FoxN1的表達(dá)，可明顯改善小鼠心臟功能，恢復(fù)和抑制血壓的升高。其可能存在的潛在機(jī)制為胸腺移植上調(diào)胸腺發(fā)育至關(guān)重要的轉(zhuǎn)錄因子FoxN1的表達(dá)，進(jìn)而引起ATRAP的表達(dá)上調(diào)，從而反過(guò)來(lái)