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文檔簡(jiǎn)介
1、心肌肥厚、心力衰竭是冠心病、心瓣膜病、高血壓等多種心血管病的常見合并癥。心肌肥厚、心力衰竭時(shí)發(fā)生的病理性電重構(gòu)使心臟的電不穩(wěn)定性增加,常伴發(fā)各種心律失常。心衰病人在泵功能穩(wěn)定的情況下半數(shù)以上因發(fā)生惡性心律失常而猝死(即心源性猝死Sudden Cardiac Death,SCD)。因此,闡明病理情況下心律失常產(chǎn)生機(jī)制,尋找藥物作用靶點(diǎn)具有重要意義。
已知心肌肥厚、心力衰竭病理發(fā)展過程中全身和局部的腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin
2、-angiotensin system,RAS)活性增加是病理性組織重構(gòu)重要的原因,該系統(tǒng)的關(guān)鍵成分血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)主要通過激活A(yù)T1受體從而激活多種細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路,對(duì)心血管功能發(fā)揮廣泛的調(diào)節(jié)作用。實(shí)驗(yàn)證明,過表達(dá)人AngⅡ基因的大鼠常因嚴(yán)重室性心動(dòng)過速而猝死;在急性分離的犬和大鼠的心室肌細(xì)胞、以及轉(zhuǎn)染編碼Ito通道基因Kv4.3哺乳細(xì)胞上,AngⅡ均可使Ito電流密度減小。上述研究結(jié)果提示,AngⅡ通過刺激AT1受體直接引起離
3、子通道的改變導(dǎo)致病理性電重構(gòu)是心律失常發(fā)生的重要原因。
哺乳類動(dòng)物心室肌細(xì)胞延遲整流鉀電流在動(dòng)作電位復(fù)極化過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用,其中快激活成份(IKr)通道孔區(qū)亞單位由human‘ether-a-go-go’related gene基因(簡(jiǎn)稱hERG)編碼,此種hERG鉀通道由于特殊的動(dòng)力學(xué)特征對(duì)動(dòng)作電位形狀、時(shí)程具有重要影響。疾病狀況下該通道功能下調(diào)引發(fā)動(dòng)作電位時(shí)程延長(zhǎng)和/或形狀改變是室性心律失常發(fā)生的重要原因。hERG鉀通道
4、由于本身的缺陷或者藥物的影響而發(fā)生變異或功能異常,產(chǎn)生先天性LQTS和獲得性LQTS,均有較高尖端扭轉(zhuǎn)型室性心律失常和猝死的危險(xiǎn)。
在前期的研究我們觀察到AngⅡ?qū)﹄嗍笮氖壹〖?xì)胞IKr和表達(dá)的IhERG呈現(xiàn)急性抑制作用,提示AngⅡ可能通過直接下調(diào)IKr參與病理?xiàng)l件下電生理重構(gòu)。已知AngⅡ可激活多條細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路引發(fā)急性和慢性生物效應(yīng),慢性效應(yīng)發(fā)生在數(shù)小時(shí)甚至更晚時(shí)間,常涉及蛋白基因轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后的改變。我們已證明AngⅡ長(zhǎng)時(shí)
5、間作用(>12h)可使表達(dá)的hERG鉀通道成熟膜蛋白明顯減少。那么,AngⅡ下調(diào)通道膜蛋白含量潛在的機(jī)制尚不清楚。
新近實(shí)驗(yàn)證明,慢性刺激一些G蛋白偶聯(lián)受體對(duì)hERG鉀通道發(fā)揮明顯的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)作用。因此,本研究主要利用分子生物學(xué)的方法,在前期研究AngⅡ作用的基礎(chǔ)上又在異源表達(dá)系統(tǒng)上進(jìn)一步研究AT1受體刺激對(duì)hERG鉀通道的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)作用(包括如何影響hERG鉀通道蛋白正向轉(zhuǎn)運(yùn)及膜蛋白入胞降解等轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)過程而改變細(xì)胞膜蛋白含
6、量)并對(duì)AngⅡ下調(diào)hERG鉀通道膜蛋白量的信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制進(jìn)行分析,這對(duì)理解離子通道病理重構(gòu)機(jī)制從而解釋心律失常發(fā)生機(jī)制具重要理論意義。
第一部分血管緊張素Ⅱ?qū)ERG鉀通道轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)作用
目的:研究AngⅡ?qū)ERG鉀通道轉(zhuǎn)錄后的調(diào)節(jié)作用。
方法:(1)Lipofectamine2000瞬時(shí)轉(zhuǎn)染:將AT1受體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到穩(wěn)態(tài)轉(zhuǎn)染的hERG-HEK293細(xì)胞上,或?qū)T1受體質(zhì)粒與hERG質(zhì)粒以1:1的比例瞬時(shí)
7、轉(zhuǎn)染到HEK293細(xì)胞上。
(2)細(xì)胞免疫熒光:將細(xì)胞用4%多聚甲醛固定后,用0.2%TritonX-100透化處理(不做透化處理省略這一步),之后用PBS配制含5%BSA的封閉液進(jìn)行封閉,加入特異性一抗和FITC標(biāo)記的二抗,用共聚焦顯微鏡觀察顯色情況。
(3)Western blot:將提取的細(xì)胞總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳,電轉(zhuǎn)移到NC膜上,用TBST配制含5%脫脂牛奶進(jìn)行封閉,加入特異性一抗和紅外熒光標(biāo)記的二
8、抗,用雙色紅外激光成像系統(tǒng)儀器掃描。
(4)In-cell western:將細(xì)胞用4%多聚甲醛固定后用TBST配制含5%脫脂牛奶封閉,加入特異性一抗和紅外熒光標(biāo)記的二抗,用雙色紅外激光成像系統(tǒng)儀器掃描。
結(jié)果:(1)Western blot檢測(cè)到目的條帶約在65kDa出現(xiàn),與AT1受體分子量大小基本一致。提示AT1受體在hERG-HEK293細(xì)胞中成功表達(dá)。
(2)AngⅡ長(zhǎng)時(shí)間孵育對(duì)hERG鉀通道蛋白含
9、量影響:AngⅡ(100nM)孵育24小時(shí)后In-cell western檢測(cè)顯示膜上成熟蛋白減少為(69%/±4%,P<0.01);細(xì)胞免疫熒光染色共聚焦顯微鏡下觀察通道蛋白在細(xì)胞膜和細(xì)胞內(nèi)分布情況,發(fā)現(xiàn)AngⅡ使未透化處理過的細(xì)胞膜上的熒光明顯減少,透化處理過的細(xì)胞膜熒光減少,胞漿熒光變化不明顯。
(3)AngⅡ?qū)ERG鉀通道蛋白正向轉(zhuǎn)運(yùn)的影響:AngⅡ孵育24h后western blot檢測(cè)到成熟蛋白的表達(dá)顯著減少為(
10、68%/±4%,P<0.01),胞漿未成熟蛋白表達(dá)沒有明顯變化(P>0.05)。而己知能夠引起hERG鉀通道轉(zhuǎn)運(yùn)障礙的Fluoxetine(3μM)或在瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的hERG鉀通道突變體A422T和H562P,均可檢測(cè)到成熟蛋白表達(dá)明顯減少,同時(shí)伴未成熟蛋白表達(dá)的明顯增加。Fluoxetine使成熟蛋白減少為(64%±2%,P<0.01),未成熟蛋白增加為(114%±5%,P<0.05)。提示AngⅡ不影響通道蛋白的正向轉(zhuǎn)運(yùn)。
(
11、4)AngⅡ?qū)ERG鉀通道膜蛋白降解的影響:已知Brefeldin A1(BFA)能夠阻斷通道正向轉(zhuǎn)運(yùn),加入BFA(10μM)使用western blot觀察不同時(shí)間成熟蛋白的降解情況,對(duì)照組在2h、4h、8h、12h、24h下降為82%±8%、70%±1%、63%±9%、55%±8%、53%±8%(P<0.05),AngⅡ組在2h、4h、8h、12h、24h下降為77%±7%、64%±9%、55%±11%、44%±12%、40%±1
12、2%(P<0.05),提示AngⅡ加速通道膜蛋白降解。Lactacystin(5μM,蛋白酶體抑制劑)明顯能夠抑制AngⅡ介導(dǎo)的成熟蛋白減少(67±4%增加為89%±3%,P<0.05),而Bafilomycin(1μM,溶酶體抑制劑)對(duì)AngⅡ的作用無明顯影響(P>0.05),提示AngⅡ加速蛋白降解主要通過蛋白酶體途徑。
結(jié)論:在異源表達(dá)系統(tǒng)上,AngⅡ長(zhǎng)時(shí)間孵育可顯著減少hERG鉀通道膜上成熟蛋白含量,其原因可能是由于膜
13、蛋白以泛素-蛋白酶體途徑降解加速引起。
第二部分血管緊張素Ⅱ下調(diào)hERG鉀通道膜蛋白含量的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制
目的:分析AngⅡ下調(diào)hERG鉀通道膜蛋白含量的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制。
方法:(1)Lipofectamine2000瞬時(shí)轉(zhuǎn)染:將AT1受體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到穩(wěn)態(tài)轉(zhuǎn)染的hERG-HEK293細(xì)胞上。
(2)Western blot:方法同第一部分。
結(jié)果:Western blot結(jié)果顯示:
14、(1)PKC抑制劑Bis I(100nM)明顯能夠抑制AngⅡ介導(dǎo)的成熟蛋白減少(64%±4%增加到90%±4%,P<0.01)。
(2)PKC激動(dòng)劑PMA(100nM)或OAG(100nM),也明顯能夠抑制AngⅡ介導(dǎo)的成熟蛋白減少(59%±5%增加到101%±5%,P<0.01:58%±4%增加到100%±5%,P<0.05)。
(3)PKA抑制劑H-89(1μM)不能抑制AngⅡ介導(dǎo)的成熟蛋白減少(P>0.05
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