炙甘草湯含藥血清對hERG鉀通道的影響.pdf

1、心律失常是臨床上常見疾病，多種疾病如高血壓，心肌梗塞，心力衰竭、心肌缺血等時常伴隨有心律失常。室性心動過速，室顫等惡性心律失常死亡率高，嚴(yán)重威脅人類的生命健康。目前經(jīng)典的抗心律失常藥物作用靶點單一，不良反應(yīng)多。雖然現(xiàn)代醫(yī)療技術(shù)的發(fā)展使臨床不斷獲益，但心律失常仍然是棘手的問題之一。近年來，人們的目光逐漸轉(zhuǎn)向傳統(tǒng)中藥，中藥用藥人群廣，應(yīng)用時間長，往往具有多靶點，多層次的優(yōu)勢，能夠從整體觀調(diào)節(jié)病人機體。作為治療心律失常的經(jīng)典名方，炙甘草湯獲得

2、了人們的青睞，研究發(fā)現(xiàn)，炙甘草湯對心律失常病人，以及多種藥物誘發(fā)的動物心律失常模型都有明顯的預(yù)防和治療作用。一般認(rèn)為炙甘草湯可以延長心肌細(xì)胞動作電位時程（APD），來對抗快速型心律失常。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，炙甘草湯含藥血清抑制L-型鈣電流和瞬時外向鉀電流（Ito）的綜合結(jié)果導(dǎo)致了APD的延長?？旒せ钛舆t整流鉀電流（Ikr）是動作電位復(fù)極3期的主要組成成分，hERG（Kv11.1）是心肌細(xì)胞中Ikr的α亞單位，與輔助亞單位KCNE1或KCNE

3、2（MiRP2）共同組成Ikr。影響Ikr會導(dǎo)致動作電位發(fā)生明顯改變，Ikr通道是抗心律失常藥物的重要靶點。炙甘草湯對Ikr的影響如何，尚未見報道。由于原生心肌細(xì)胞Ikr電流較小，且不易與其他鉀電流分離，所以本研究采用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染hERG的HEK293細(xì)胞系，在細(xì)胞和分子水平上探討炙甘草湯對Ikr通道的影響。
　　本研究采用膜片鉗技術(shù)，觀察了炙甘草湯含藥血清對兔心肌細(xì)胞動作電位的作用，進(jìn)一步探討了炙甘草湯含藥血清對表達(dá)在HEK293細(xì)

4、胞中hERG鉀通道的作用,希望為解釋該方抗心律失常提供新的思路，為中藥的開發(fā)及現(xiàn)代化研究做出貢獻(xiàn)。
　　第一部分炙甘草湯含藥血清對兔心室肌細(xì)胞動作電位的影響
　　目的：在急性分離的兔心室肌細(xì)胞中探究炙甘草湯含藥血清對動作電位（AP）的影響。
　　方法：炙甘草湯按照傳統(tǒng)工藝煎煮，濃縮。兔連續(xù)灌胃5天后取血，離心，得到相應(yīng)血清。酶解法急性分離正常兔心室肌細(xì)胞，采用穿孔膜片鉗技術(shù)記錄動作電位，比較不同濃度空白血清和含藥血清對

5、動作電位的影響。
　　結(jié)果：與藥前相比，不同濃度空白血清對兔心肌細(xì)胞動作電位無明顯影響，而含藥血清則濃度依賴性地延長了APD。與給藥前相比，5％，10%，20%，40%的含藥血清分別使兔心肌細(xì)胞的APD50延長了14.17%，56.26%，44.61%和87.06%，APD90延長了10.07%，26.54%，45.86%和55.49%，沖洗后APD50和APD90可部分恢復(fù)，但沒有達(dá)到藥前水平。不同濃度的含藥血清對兔心肌細(xì)胞AP

6、A和Vmax沒有顯著影響。
　　結(jié)論：炙甘草湯含藥血清濃度依賴性延長兔心室肌細(xì)胞動作電位時程。
　　第二部分炙甘草湯含藥血清對hERG鉀通道的作用
　　目的：觀察灌流給予炙甘草湯含藥血清對hERG鉀電流的影響，并從通道動力學(xué)角度闡述給藥引起電流變化的原因。
　　方法：在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染hERG的HEK293細(xì)胞中灌流給予0%，5%，10%，20%，40%空白血清和含藥血清，全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)記錄hERG鉀電流，觀察空白血清

7、及含藥血清對電流的影響。
　　結(jié)果：（1）空白血清和含藥血清對hERG鉀電流的作用：給予20%含藥血清5 min后，抑制作用達(dá)到最大，沖洗后電流不能完全恢復(fù)；+20mV下5%，10%，20%，40%含藥血清對hERG鉀電流的抑制率分別為15.73%，38.15%，46.73%和51.09%，用Hill方程擬合量效關(guān)系曲線后得到IC50為15.47%，20%空白血清給藥后沒有抑制作用。（2）空白血清和含藥血清對hERG鉀電流大小的影

8、響：5%-40%空白血清對hERG鉀電流的電流大小沒有影響，5%-40%含藥血清可以明顯減小hERG鉀電流。與0%含藥血清相比，5%-40%含藥血清使激活曲線左移,半數(shù)激活電壓從0%含藥血清的-13.21±1.04mV分別減小為-18.01±0.62mV，-17.84±0.69mV，-20.26±0.52mV，-20.70±0.52mV，對曲線斜率因子k無顯著影響。（3）20%炙甘草湯含藥血清對hERG鉀通道激活過程的影響：激活時間常數(shù)

9、顯示隨著去極化電壓增大，激活時間變短，相同激活電壓下，含藥血清使激活時間變長，減慢了hERG鉀通道的激活。（4）20%炙甘草湯含藥血清對hERG鉀通道去活過程的影響：隨著去極化電壓的增大，快、慢去活時間常數(shù)也隨之增大。相同電壓下，20%含藥血清可以增加快、慢去活時間常數(shù)，延長去活過程，沖洗可部分恢復(fù)但不能完全糾正含藥血清對去活過程的影響。（5）20%炙甘草湯含藥血清對hERG鉀通道穩(wěn)態(tài)失活過程的影響：給予20%含藥血清后半數(shù)失活電壓增加

10、了4.34mV，普通外液沖洗后可使半數(shù)激活電壓恢復(fù)到藥前水平，即20%含藥血清可以加速hERG鉀通道的失活過程，沖洗后可恢復(fù)含藥血清對hERG鉀通道穩(wěn)態(tài)失活過程的影響。（6）20%炙甘草湯含藥血清對hERG鉀通道復(fù)活過程的影響：20%含藥血清延長復(fù)活時間常數(shù)，減慢通道恢復(fù)，沖洗后可部分恢復(fù)但不能完全糾正含藥血清對復(fù)活過程的影響。
　　結(jié)論：炙甘草湯含藥血清通過加速hERG通道失活，減慢hERG通道激活、去活和復(fù)活來降低hERG電流