炙甘草湯含藥血清對hERG鉀通道的影響.pdf

1、心律失常是臨床上常見疾病，多種疾病如高血壓，心肌梗塞，心力衰竭、心肌缺血等時常伴隨有心律失常。室性心動過速，室顫等惡性心律失常死亡率高，嚴重威脅人類的生命健康。目前經(jīng)典的抗心律失常藥物作用靶點單一，不良反應多。雖然現(xiàn)代醫(yī)療技術的發(fā)展使臨床不斷獲益，但心律失常仍然是棘手的問題之一。近年來，人們的目光逐漸轉(zhuǎn)向傳統(tǒng)中藥，中藥用藥人群廣，應用時間長，往往具有多靶點，多層次的優(yōu)勢，能夠從整體觀調(diào)節(jié)病人機體。作為治療心律失常的經(jīng)典名方，炙甘草湯獲得

2、了人們的青睞，研究發(fā)現(xiàn)，炙甘草湯對心律失常病人，以及多種藥物誘發(fā)的動物心律失常模型都有明顯的預防和治療作用。一般認為炙甘草湯可以延長心肌細胞動作電位時程（APD），來對抗快速型心律失常。進一步研究發(fā)現(xiàn)，炙甘草湯含藥血清抑制L-型鈣電流和瞬時外向鉀電流（Ito）的綜合結(jié)果導致了APD的延長?？旒せ钛舆t整流鉀電流（Ikr）是動作電位復極3期的主要組成成分，hERG（Kv11.1）是心肌細胞中Ikr的α亞單位，與輔助亞單位KCNE1或KCNE

3、2（MiRP2）共同組成Ikr。影響Ikr會導致動作電位發(fā)生明顯改變，Ikr通道是抗心律失常藥物的重要靶點。炙甘草湯對Ikr的影響如何，尚未見報道。由于原生心肌細胞Ikr電流較小，且不易與其他鉀電流分離，所以本研究采用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染hERG的HEK293細胞系，在細胞和分子水平上探討炙甘草湯對Ikr通道的影響。
　　本研究采用膜片鉗技術，觀察了炙甘草湯含藥血清對兔心肌細胞動作電位的作用，進一步探討了炙甘草湯含藥血清對表達在HEK293細

4、胞中hERG鉀通道的作用,希望為解釋該方抗心律失常提供新的思路，為中藥的開發(fā)及現(xiàn)代化研究做出貢獻。
　　第一部分炙甘草湯含藥血清對兔心室肌細胞動作電位的影響
　　目的：在急性分離的兔心室肌細胞中探究炙甘草湯含藥血清對動作電位（AP）的影響。
　　方法：炙甘草湯按照傳統(tǒng)工藝煎煮，濃縮。兔連續(xù)灌胃5天后取血，離心，得到相應血清。酶解法急性分離正常兔心室肌細胞，采用穿孔膜片鉗技術記錄動作電位，比較不同濃度空白血清和含藥血清對

5、動作電位的影響。
　　結(jié)果：與藥前相比，不同濃度空白血清對兔心肌細胞動作電位無明顯影響，而含藥血清則濃度依賴性地延長了APD。與給藥前相比，5％，10%，20%，40%的含藥血清分別使兔心肌細胞的APD50延長了14.17%，56.26%，44.61%和87.06%，APD90延長了10.07%，26.54%，45.86%和55.49%，沖洗后APD50和APD90可部分恢復，但沒有達到藥前水平。不同濃度的含藥血清對兔心肌細胞AP

6、A和Vmax沒有顯著影響。
　　結(jié)論：炙甘草湯含藥血清濃度依賴性延長兔心室肌細胞動作電位時程。
　　第二部分炙甘草湯含藥血清對hERG鉀通道的作用
　　目的：觀察灌流給予炙甘草湯含藥血清對hERG鉀電流的影響，并從通道動力學角度闡述給藥引起電流變化的原因。
　　方法：在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染hERG的HEK293細胞中灌流給予0%，5%，10%，20%，40%空白血清和含藥血清，全細胞膜片鉗技術記錄hERG鉀電流，觀察空白血清

7、及含藥血清對電流的影響。
　　結(jié)果：（1）空白血清和含藥血清對hERG鉀電流的作用：給予20%含藥血清5 min后，抑制作用達到最大，沖洗后電流不能完全恢復；+20mV下5%，10%，20%，40%含藥血清對hERG鉀電流的抑制率分別為15.73%，38.15%，46.73%和51.09%，用Hill方程擬合量效關系曲線后得到IC50為15.47%，20%空白血清給藥后沒有抑制作用。（2）空白血清和含藥血清對hERG鉀電流大小的影

8、響：5%-40%空白血清對hERG鉀電流的電流大小沒有影響，5%-40%含藥血清可以明顯減小hERG鉀電流。與0%含藥血清相比，5%-40%含藥血清使激活曲線左移,半數(shù)激活電壓從0%含藥血清的-13.21±1.04mV分別減小為-18.01±0.62mV，-17.84±0.69mV，-20.26±0.52mV，-20.70±0.52mV，對曲線斜率因子k無顯著影響。（3）20%炙甘草湯含藥血清對hERG鉀通道激活過程的影響：激活時間常數(shù)

9、顯示隨著去極化電壓增大，激活時間變短，相同激活電壓下，含藥血清使激活時間變長，減慢了hERG鉀通道的激活。（4）20%炙甘草湯含藥血清對hERG鉀通道去活過程的影響：隨著去極化電壓的增大，快、慢去活時間常數(shù)也隨之增大。相同電壓下，20%含藥血清可以增加快、慢去活時間常數(shù)，延長去活過程，沖洗可部分恢復但不能完全糾正含藥血清對去活過程的影響。（5）20%炙甘草湯含藥血清對hERG鉀通道穩(wěn)態(tài)失活過程的影響：給予20%含藥血清后半數(shù)失活電壓增加

10、了4.34mV，普通外液沖洗后可使半數(shù)激活電壓恢復到藥前水平，即20%含藥血清可以加速hERG鉀通道的失活過程，沖洗后可恢復含藥血清對hERG鉀通道穩(wěn)態(tài)失活過程的影響。（6）20%炙甘草湯含藥血清對hERG鉀通道復活過程的影響：20%含藥血清延長復活時間常數(shù)，減慢通道恢復，沖洗后可部分恢復但不能完全糾正含藥血清對復活過程的影響。
　　結(jié)論：炙甘草湯含藥血清通過加速hERG通道失活，減慢hERG通道激活、去活和復活來降低hERG電流