細(xì)胞外基質(zhì)蛋白mindin與整合素CD11b-CD18相互作用并激活Syk-MAPK和NF-κB途徑促進(jìn)巨噬細(xì)胞的趨化、吞噬.pdf

1、Mindin（也稱為spondin2）作為F/M-spondin家族的一員是一種結(jié)構(gòu)高度保守的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，含有FS1、FS2和WSXW模序的TSR結(jié)構(gòu)域，在先天性免疫系統(tǒng)中具有重要的作用[1]。近期研究發(fā)現(xiàn)，作為模式識(shí)別分子mindin能直接與細(xì)菌的表面抗原比如脂多糖(LPS)，磷脂(LTA)等結(jié)合[2]。Mindin基因缺陷型小鼠能抵抗脂多糖引起的感染性休克，并且清除細(xì)菌感染能力受損[3]。巨噬細(xì)胞以及肥大細(xì)胞表現(xiàn)出對(duì)廣譜細(xì)菌刺激

2、缺陷的反應(yīng)，他們分泌的炎癥細(xì)胞因子TNF-a和IL-6有明顯的缺失[4]。故本課題主要探討mindin對(duì)巨噬細(xì)胞的招募和吞噬作用的機(jī)制及下游的信號(hào)通路。
　　本課題研究首先構(gòu)建了一種趨化反應(yīng)體外模型，即利用瓊脂糖包被mindin重組蛋白誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞趨化，成功模擬并檢測(cè)mindin具有招募巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞的功能。其次，本課題應(yīng)用吞噬實(shí)驗(yàn)，利用熒光顯微鏡和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)巨噬細(xì)胞對(duì)熒光乳膠微粒的吞噬個(gè)數(shù)，發(fā)現(xiàn)mindin能促進(jìn)巨噬細(xì)

3、胞的吞噬作用。此上研究方法模擬了炎癥環(huán)境，降低其他炎癥因子的干擾，對(duì)單一因子對(duì)炎癥的反應(yīng)的研究具有參考意義。再次，本課題還利用CIPHER的技術(shù)篩選出整合素CD11b和CD18等5種配體與mindin具有相關(guān)性，通過免疫共沉淀明確mindin能與CD11b與CD18相互結(jié)合。為了進(jìn)一步明確其結(jié)合結(jié)構(gòu)域，我們通過分子克隆方法，構(gòu)建了mindin與CD11b/CD18不同片段的質(zhì)粒進(jìn)行免疫共沉淀，發(fā)現(xiàn)mindin的FS片段與整合素CD11b

4、/CD18的αα11區(qū)域結(jié)合，并用放射線同位素標(biāo)記mindin測(cè)出這兩者的親和力。為了驗(yàn)證mindin是否通過整合素CD11b/CD18的途徑誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞的趨化和吞噬作用，我們利用CD11b/CD18的中和抗體M1/70，M18/2阻斷與mindin結(jié)合，在趨化和吞噬模型中mindin的作用明顯下降?？梢妋indin是通過與整合素CD11b/CD18的相互作用誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞的趨化和吞噬功能。用western blot和核漿分離等技術(shù)進(jìn)一步

5、發(fā)現(xiàn)mindin能促進(jìn)整合素CD11b/CD18下游的syk的磷酸化，并且沿著MERK1/2-ERK1/2這條通路，而非AKT通路。
　　本課題以構(gòu)建體外的炎癥模型的實(shí)驗(yàn)方法研究mindin在炎癥反應(yīng)中的功能并探討了mindin在炎癥中主要與整合素CD11b/CD18的相互作用促進(jìn)巨噬細(xì)胞的趨化和吞噬。并且明確了其下游的信號(hào)通路包括促進(jìn)整合素CD11b/CD18下游Syk的磷酸化和MEK、ERK的磷酸化，誘導(dǎo)NF酸化，誘導(dǎo)D的入核