MSMEG_6387基因敲除對(duì)THP-1細(xì)胞免疫功能的影響季煜.pdf

1、結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)是胞內(nèi)致病菌，也是引起結(jié)核病的主要致病菌。隨著抗結(jié)核藥的長(zhǎng)期使用，耐藥菌株不斷增加，加大了控制結(jié)核病的難度。MTB獨(dú)特的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)使得它能逃脫免疫系統(tǒng)的監(jiān)視，在肺部巨噬細(xì)胞內(nèi)生存繁殖而致病。脂阿拉伯甘露聚糖(lipoarabinomannan，LAM)是MTB細(xì)胞壁的主要成分之一，不同分枝桿菌菌株的細(xì)胞壁LAM結(jié)構(gòu)不同，這種結(jié)構(gòu)差異能引起宿主產(chǎn)生不同的免疫反應(yīng)。

2、EmbC基因編碼的阿拉伯糖轉(zhuǎn)移酶參與了LAM結(jié)構(gòu)中阿拉伯糖基的轉(zhuǎn)移和聚合，C末端不同長(zhǎng)度縮短的EmbC基因能合成不同結(jié)構(gòu)的LAM。恥垢分枝桿菌（Mycobacterium smegmatis mc2155，M. smegmatis）是 MTB的模式菌，MSMEG_6387為 EmbC的的同源基因。本研究通過(guò)建立MSMEG_6387基因敲除菌株，得到細(xì)胞壁LAM結(jié)構(gòu)差異的M. smegmatis突變菌株，進(jìn)一步研究 LAM結(jié)構(gòu)差異對(duì)人單核

3、巨噬細(xì)胞 THP-1免疫學(xué)活性的影響，為完善LAM結(jié)構(gòu)與MTB免疫逃逸機(jī)制研究鑒定基礎(chǔ)。
　　目的：
　　1.構(gòu)建MSMEG_6387基因敲除菌株，鑒定MSMEG_6387基因敲除后細(xì)胞壁LAM的結(jié)構(gòu)變化。
　　2.探討MSMEG_6387基因敲除菌株對(duì)THP-1細(xì)胞凋亡以及免疫學(xué)活性的影響，為研究LAM結(jié)構(gòu)與宿主天然免疫反應(yīng)之間的關(guān)系提供線(xiàn)索。
　　方法：
　　1.首先，通過(guò)分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建了條件性復(fù)制

4、質(zhì)粒
　　pPR27-xylE-MSMEG_6387:kanR，再利用同源重組技術(shù)將該重組質(zhì)粒與M. smegmatis基因組DNA進(jìn)行同源重組，通過(guò)抗生素和蔗糖壓力篩選得到重組成功菌株。再利用PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物測(cè)序方式鑒定MSMEG_6387:kanR的同源重組位置和方式，從而得到MSMEG_6387基因敲除菌株，命名為M. sm-ΔM_6387。
　　2.利用氯仿-甲醇萃取，提取M. smegmatis和M. sm-ΔM_

5、6387的細(xì)胞壁LAM成分，通過(guò)碘酸雪夫染色（Periodic acid-Schiff stain，PAS）方法檢測(cè)不同菌株細(xì)胞壁LAM的結(jié)構(gòu)。
　　3.為進(jìn)一步了解 M. sm-ΔM_6387菌株的生物學(xué)結(jié)構(gòu)和功能變化，分別從以下四個(gè)方面進(jìn)行分析。（1）以M.smegmatis為對(duì)照，測(cè)定M. sm-ΔM_6387菌株的吸光度值并繪制生長(zhǎng)曲線(xiàn)，觀(guān)察 MSMEG_6387基因敲除對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的影響。（2）利用透射電子顯微鏡(Tran

6、smission electron microscopy，TEM)，觀(guān)察MSMEG_6387功能缺失引起的細(xì)胞壁超微結(jié)構(gòu)的變化。（3）利用掃描電子顯微鏡（Scanning electron microscopy，SEM）檢測(cè)MSMEG_6387基因功能缺失對(duì)菌體形態(tài)的影響。（4）利用抗酸染色法(acid-fast staining method)檢測(cè)MSMEG_6387基因敲除對(duì)菌體嗜酸性的影響。
　　4.為了進(jìn)一步研究LAM結(jié)構(gòu)

7、變化對(duì)宿主免疫活性的影響。我們利用THP-1單核巨噬細(xì)胞，檢測(cè)不同 LAM結(jié)構(gòu)的菌株對(duì)細(xì)胞凋亡及免疫活性的影響，首先利用10 ng/ml的豆蔻酰佛波醇乙酯（Phorbol-12-myristate-13-acetate，PMA)誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞分化成巨噬細(xì)胞，再將M. smegmatis與M. sm-ΔM_6387菌株均以10:1感染復(fù)數(shù)（MOI）侵染THP-1巨噬細(xì)胞，分別從以下五種方面分析THP-1細(xì)胞功能和活性變化。（1）通過(guò)

8、MTT(Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide)方法檢測(cè)MSMEG_6387基因功能缺失對(duì) THP-1細(xì)胞毒性的影響。（2）通過(guò)流式細(xì)胞技術(shù)(Flow cytometry,FCM)測(cè)定不同結(jié)構(gòu)的LAM菌株對(duì)THP-1細(xì)胞凋亡的影響。（3）通過(guò)實(shí)時(shí)定量基因擴(kuò)增熒光檢測(cè)（Real-time quantitative PCR，qPCR）檢測(cè)LAM結(jié)構(gòu)變化對(duì) TLR2激活的影響。（4）通過(guò)酶聯(lián)免疫

9、吸附劑測(cè)定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)方法檢測(cè)MSMEG_6387基因功能缺失對(duì)THP-1細(xì)胞分泌早期炎癥反應(yīng)因子 IL-12和 IL-1β表達(dá)的影響。（5）通過(guò)一氧化氮合成酶檢測(cè)試劑盒檢測(cè) MSMEG_6387基因功能缺失對(duì) THP-1細(xì)胞分泌一氧化氮(nitrogen monoxide，NO)的影響。
　　結(jié)果：
　　1.成功構(gòu)建了M. sm-ΔM_6387菌株，并提

10、取了M. smegmatis和M. sm-ΔM_6387菌株的細(xì)胞壁LAM混合物。PAS染色結(jié)果表明，與M. smegmatis的LAM粗提物結(jié)構(gòu)相比，M. sm-ΔM_6387菌株合成的LAM分子量較小，LAM結(jié)構(gòu)變化。
　　2.生長(zhǎng)曲線(xiàn)結(jié)果表明，MSMEG_6387基因敲除抑制了細(xì)菌生長(zhǎng)。TEM結(jié)果表明，M. sm-ΔM_6387菌株菌體細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)內(nèi)陷。SEM結(jié)果表明，M. sm-ΔM_6387菌體長(zhǎng)度變短，但未見(jiàn)明顯形態(tài)改變

11、?？顾崛旧治霭l(fā)現(xiàn)，M. sm-ΔM_6387菌株酸性染色陽(yáng)性細(xì)胞減少。
　　3.MTT檢測(cè)結(jié)果表明，M. sm-ΔM_6387菌株對(duì)THP-1細(xì)胞無(wú)毒性，并且還能引起THP-1細(xì)胞增殖加快。FCM結(jié)果表明，M. smegmatis和M. sm-ΔM_6387菌株均引起THP-1細(xì)胞凋亡，其中M. sm-ΔM_6387菌株引起細(xì)胞凋亡率相對(duì)較低。qPCR結(jié)果表明，MSMEG_6387基因敲除引起TLR2基因表達(dá)上調(diào)。ELISA結(jié)果

12、表明，MSMEG_6387基因敲除引起THP-1細(xì)胞IL-12和IL-1β表達(dá)上調(diào)。同時(shí)NO分泌增多。
　　結(jié)論：
　　本論文研究結(jié)果表明，MSMEG_6387基因參與恥垢分枝桿菌細(xì)胞壁上的LAM合成，并引起 LAM結(jié)構(gòu)變化及分子量降低。MSMEG_6387基因敲除抑制了細(xì)菌生長(zhǎng)，引起菌體細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，細(xì)胞形態(tài)以及嗜酸染色的變化。因此我們推測(cè)MSMEG_6387基因與 MTB細(xì)胞壁 LAM合成以及維持細(xì)胞壁完整性密切相關(guān)。LA