rhGM-CSF對(duì)單核細(xì)胞THP-1表達(dá)CCR2的影響.pdf

1、 靜脈血栓是血管外科臨床常見(jiàn)的一種疾病。靜脈血栓以下肢深靜脈血栓形成多見(jiàn)。目前國(guó)內(nèi)外靜脈血栓的治療策略主要是抗凝、祛聚和溶栓等非手術(shù)措施?？鼓挽罹壑委煹哪康脑谟诜乐剐碌难ㄐ纬桑L(zhǎng)期應(yīng)用抗凝和祛聚藥物有導(dǎo)致嚴(yán)重出血的風(fēng)險(xiǎn)。而溶栓治療雖然能溶解已形成的血栓，但溶栓藥物只能作用于血栓的表面，很難進(jìn)入血栓內(nèi)部發(fā)揮作用，因而直接溶栓治療還沒(méi)有成為一種標(biāo)準(zhǔn)的治療策略。靜脈血栓常引起血栓后綜合癥（postthrombotic syndr

2、ome），其治療效果欠佳且費(fèi)用昂貴。 靜脈血栓的溶解和吸收主要是依賴于機(jī)體自身的慢性自然溶解機(jī)制。包括纖維蛋白溶酶介導(dǎo)的纖維蛋白溶解和蛋白水解酶介導(dǎo)的膠質(zhì)崩解等。新生肉芽組織長(zhǎng)入血栓并取代血栓的過(guò)程即是血栓的機(jī)化過(guò)程。在血栓形成后的1-2天，單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞等在趨化因子的作用下進(jìn)入血栓內(nèi)部，隨著肉芽組織的增生，新生血管逐漸形成，血流可通過(guò)這些管腔而實(shí)現(xiàn)靜脈血管的再通。如果機(jī)體對(duì)血栓的溶解和吸收徹底，血

3、管可完全再通，否則形成邊緣毛燥、管徑粗細(xì)不一的再通靜脈。并伴隨著靜脈瓣膜的破壞，形成一個(gè)管腔通暢但瓣膜關(guān)閉不全的靜脈系統(tǒng)，造成靜脈血液的逆流，最終引起血栓后綜合癥。因而增加微血管的生成和促進(jìn)血栓的機(jī)化可減輕靜脈瓣膜的損害和再通靜脈的阻塞，從而預(yù)防血栓后綜合癥的發(fā)生。 最近研究發(fā)現(xiàn)，單核細(xì)胞在靜脈血栓的溶解和吸收中發(fā)揮重要的作用。單核細(xì)胞能夠釋放和介導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞前血管生成因子的釋放。在體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)中均發(fā)現(xiàn)，血栓中的新生血管主

4、要出現(xiàn)在單核-巨噬細(xì)胞聚集的區(qū)域。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在靜脈血栓中注入單核-巨噬細(xì)胞可以促進(jìn)其溶解。更新的研究顯示，通過(guò)骨髓動(dòng)員，各種來(lái)源于骨髓的干細(xì)胞和祖細(xì)胞參與了靜脈血栓的溶解和吸收。 早期的研究已經(jīng)揭示趨化因子在深靜脈血栓的溶解中發(fā)揮極其重要的作用。趨化因子是體內(nèi)廣泛存在的一類肽類炎癥介質(zhì)。它們扮演著趨化白細(xì)胞到達(dá)作用靶位和激活白細(xì)胞特有功能的角色。趨化因子主要有四個(gè)亞族。其中與深靜脈血栓溶解關(guān)系最密切的是CC類和CXC類趨化因

5、子。在實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭邪l(fā)現(xiàn)，加入外源性的MCP-1（一種CC類趨化因子）和IL-8（一種CXC類趨化因子）均能加速血栓的溶解。趨化因子與其特異性受體一起構(gòu)成細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而發(fā)揮其對(duì)靶細(xì)胞的趨化、激活等作用。 CC類趨化因子主要趨化和激活單核細(xì)胞。它的作用需要通過(guò)其相應(yīng)的受體CCR來(lái)實(shí)現(xiàn)。MCP-1與其特異性受體CCR2構(gòu)成MCP-1/CCR2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與單核細(xì)胞的遷移和游走，對(duì)于單核細(xì)胞的募集極為重要。有研究發(fā)現(xiàn)，CCR2

6、基因敲除可抑制單核細(xì)胞在血栓中的聚集，MMP-2和MMP-9活性降低，血栓中膠原含量增加，血栓的體積增大，其溶解受到明顯抑制。 因此我們?cè)O(shè)想，若能主動(dòng)增強(qiáng)靜脈血栓中單核細(xì)胞的功能，一定有助于促進(jìn)靜脈血栓的溶解，實(shí)現(xiàn)血管的早期再通，減少血栓后綜合癥的發(fā)生。本研究擬探討通過(guò)運(yùn)用細(xì)胞因子rhGM-CSF來(lái)增加單核細(xì)胞CCR2的表達(dá)，從而促進(jìn)其聚集，為進(jìn)一步研究其在靜脈血栓溶解中的機(jī)制打下一定的理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 研究方法：

7、 1.細(xì)胞實(shí)驗(yàn) 人單核細(xì)胞株THP-1培養(yǎng)于含10％胎牛血清、2.0mmol/L谷氨酰胺、10.0mmol/L HEPES、1.0 mmol/L丙酮酸鈉、5.0×10-5mol/Lβ-巰基乙醇、1.0×105U/L青霉素、100mg/L鏈霉素的，RPMI-1640培養(yǎng)液中。培養(yǎng)液中加入終濃度為0、40、80、160ng/ml的thGM-CSF。1×105個(gè)細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)板，6×105個(gè)細(xì)胞接種于100ml培養(yǎng)瓶。

8、 ELISA法檢測(cè)培養(yǎng)液中MCP-1的水平，操作按人MCP-1 ELISA Kit說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。 培養(yǎng)的THP-1細(xì)胞總RNA提取按柱式小量細(xì)胞總RNA抽提試劑盒的說(shuō)明步驟進(jìn)行。RT-PCR擴(kuò)增參照TaKaRa RNA PCR Kit（AMV）Ver.3.0試劑盒操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。PCR產(chǎn)物用2％瓊脂糖進(jìn)行凝膠電泳，Goldview染色。凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)。 按照細(xì)胞總蛋白提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取THP-1細(xì)胞總蛋白

9、。等量蛋白加樣于40％的聚丙烯酰胺/甲叉雙丙烯酰胺凝膠后120V電壓下電泳，電轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上。TBST封閉過(guò)夜。1：400兔抗人CCR2抗體溫育1.5h。洗膜，1：4，000 HRP結(jié)合的羊抗兔IgG抗體溫育2h。內(nèi)參照GAPDH的檢測(cè)同上述方法。結(jié)果以化學(xué)發(fā)光法顯色后進(jìn)行OD值測(cè)定。 2.統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有數(shù)據(jù)根據(jù)具體資料采用F僉驗(yàn)、Dunnett檢驗(yàn)等檢驗(yàn)方法。以P

10、值<0.05為差異有顯著性。 結(jié)果： 1. THP-1細(xì)胞生長(zhǎng)情況 THP-1細(xì)胞培養(yǎng)24和48h后計(jì)數(shù)池計(jì)數(shù)。結(jié)果顯示rhGM-CSF對(duì)THP-1細(xì)胞的生長(zhǎng)沒(méi)有促進(jìn)或抑制作用。 2. MCP-1的水平 培養(yǎng)24h和48h后，THP-1細(xì)胞培養(yǎng)液中MCP-1水平在不同濃度組間均沒(méi)有顯著性差異。顯示rhGM-CSF對(duì)THP-1細(xì)胞分泌MCP-1沒(méi)有促進(jìn)或抑制作用。 3. CCR2 mRNA

11、的表達(dá) 不同濃度組中，80ng/ml rhGM-CSF濃度組對(duì)THP-1細(xì)胞CCR2mRNA的表達(dá)促進(jìn)作用最強(qiáng)。THP-1細(xì)胞在含80ng/ml rhGM-CSF的培養(yǎng)液中培養(yǎng)36和48h后，其CCR2mRNA的表達(dá)穩(wěn)定增強(qiáng)。 4. CCR2蛋白的表達(dá) 不同濃度組中，80ng/ml rhGM-CSF濃度組對(duì)THP-1細(xì)胞CCR2蛋白的表達(dá)促進(jìn)作用最強(qiáng)。THP-1細(xì)胞在含80ng/ml rhGM-CSF的培養(yǎng)液中培