非B細胞來源Igκ保守序列特異性抗體應(yīng)用的初步研究與ECDI交聯(lián)的人脾淋巴細胞誘導(dǎo)供者特異性耐受的實驗體系初步建立.pdf

1、本文主要從以下幾個部分進行論述：
　　第一部分 非B細胞來源Igκ保守序列特異性抗體應(yīng)用的初步研究
　　傳統(tǒng)免疫球蛋白(Ig)是由B淋巴細胞接受抗原刺激后增殖分化為漿細胞所分泌的重要的免疫分子，兩種表現(xiàn)形式分別為分泌型與膜型。分泌型Ig主要是以抗體形式存在體液中，特異性結(jié)合相應(yīng)的抗原發(fā)揮多種免疫功能，因此，在特異性體液免疫中發(fā)揮重要作用;膜型Ig是以B細胞抗原受體(BCR)的形式存在B細胞表面，對于細胞活化、抗原識別、分化及

2、程序性細胞死亡中起重要作用。
　　目前的免疫學(xué)理論認為在正常的機體內(nèi)，免疫球蛋白基因僅在B淋巴細胞發(fā)育過程中選擇性進行重組，而該基因在其它體細胞中處于胚系狀態(tài)，是B淋巴細胞的特征性產(chǎn)物。但是，關(guān)于非B淋巴細胞產(chǎn)生Ig分子的現(xiàn)象逐漸被國內(nèi)外學(xué)者認可。2003年北京大學(xué)邱曉彥教授首次發(fā)現(xiàn)上皮來源腫瘤細胞（非淋巴性腫瘤）及部分增生正常上皮細胞可產(chǎn)生Ig。邱曉彥教授課題組進一步研究發(fā)現(xiàn)該Ig可能具有生長因子樣活性，對腫瘤生長以及增殖有重要

3、的作用，并且發(fā)現(xiàn)癌細胞產(chǎn)生的Ig分子基因表達調(diào)控機制以及結(jié)構(gòu)與來源B淋巴細胞的Ig典型特征完全不同。
　　B淋巴細胞可產(chǎn)生多種不同特異性的Ig來應(yīng)對多種抗原。理論認為，Ig是以可變區(qū)（V區(qū)）結(jié)合相應(yīng)抗原，因而V區(qū)的多樣性是保證應(yīng)對、識別或結(jié)合理論所有抗原的基礎(chǔ)。免疫球蛋白Ig由胚系基因編碼，而基因片段需要基因重排成為功能性編碼基因。Ig可變區(qū)的多樣性來源于B淋巴細胞中基因組發(fā)生重排組合以及連接與抗原刺激后誘發(fā)的B淋巴細胞高頻突變。

4、傳統(tǒng)免疫學(xué)理論認為，Ig只在B淋巴細胞發(fā)育過程中選擇性重排。邱曉彥教授課題組研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌、肺癌、卵巢癌、腸癌、胃癌、鼻咽癌、胰腺癌等上皮來源腫瘤細胞及部分正常上皮細胞內(nèi)Ig存在功能性基因重排。不同類型的腫瘤細胞表達完全相同的可變區(qū)序列，同一個體以及不同個體腫瘤細胞來源的Ig序列表達高度同源，研究發(fā)現(xiàn)在B細胞表達的Ig數(shù)據(jù)庫均未發(fā)現(xiàn)這些序列，提示Ig為非B淋巴細胞產(chǎn)生，來源于腫瘤細胞。腫瘤來源的Ig基因轉(zhuǎn)錄本具有獨特基因結(jié)構(gòu)，在不同類型

5、的腫瘤細胞，尤其是輕鏈在所有檢測病例均表達極為相似的重排模式（個別堿基的替換）或同一結(jié)構(gòu)保守序列，即Vκ4-1-Jκ3型Ig轉(zhuǎn)錄本。
　　考慮到Vκ4-1-Jκ3型Igs最初發(fā)現(xiàn)于腫瘤，因此可能成為腫瘤研究、診斷乃至治療的靶點，關(guān)鍵在于獲得針對Vκ4-1-Jκ3結(jié)構(gòu)特異性抗體。作為與北京大學(xué)邱曉彥教授的合作課題，課題組前期利用生物信息學(xué)方法分析預(yù)測了Vκ4-1-Jκ3型Ig兩個特異性的B細胞識別表位，設(shè)計合成三個短肽，分別為QF2

6、0(QAEDVAVYYCQQYYDTPVTF), AL13(序列 ASINCKSSQRVSL), AL13B(TQSPDSLVVSLGERASINCKSSQRVSLG，即AL13的延長序列)，并獲贈邱曉彥教授課題組提供的原核表達Vκ4-1-Jκ3型Ig融合蛋白(GST-Vκ4-1-Jκ3)。以合成肽AL13B-KLH、原核蛋白GST-Vκ4-1-Jκ3免疫小鼠獲得系列單克隆抗體。獲得的抗Vκ4-1-Jκ3型Ig特異性表位抗體，為研究非B

7、淋巴細胞、組織液以及血液中可溶性Vκ4-1-Jκ3型Ig表達提供強有效工具。
　　本項研究主要目的是對抗Vκ4-1-Jκ3型Ig特異性表位單抗的鑒定以及建立雙單抗夾心ELISA檢測體系及其應(yīng)用。我們用ELISA鑒定抗體的特異性，這部分工作主要是在課題組前期抗Vκ4-1-Jκ3型Ig單抗制備工作的繼續(xù)。Vκ4-1-Jκ3型Ig最早發(fā)現(xiàn)于上皮來源腫瘤細胞，擬建立雙單抗夾心ELISA檢測體系，檢測可溶性（分泌型）Vκ4-1-Jκ3型Ig

8、κ，觀察正常人與腫瘤病人血清中的Vκ4-1-Jκ3型Ig表達總量是否存在差異。
　　雙單抗夾心ELISA檢測Vκ4-1-Jκ3型Ig體系建立與應(yīng)用
　　抗Vκ4-1-Jκ3單抗特異性的鑒定 Vκ4-1-Jκ3型Ig早期發(fā)現(xiàn)來源于上皮性腫瘤，基本結(jié)構(gòu)與正常Ig相同。課題組前期采用原核蛋白GST-Vκ4-1-Jκ3免疫小鼠獲得了單克隆抗體4E9與1A3;用合成肽AL13B-KLH免疫小鼠獲得單克隆抗體6G5、5D3與3H9.2。

9、采用辛酸硫酸銨沉淀法純化單抗，ELISA鑒定純化后的單抗以及生物素標記單抗的特異性。結(jié)果顯示抗Vκ41-Jκ3型Ig單抗能特異性地與原核重組蛋白GST-Vκ4-1-Jκ3結(jié)合，且與人IgG與鼠IgG并無交叉反應(yīng)。因此5種抗Vκ4-1-Jκ3型Ig單抗與生物素標記單抗均可用于后續(xù)雙單抗夾心ELISA體系的建立。
　　雙單抗夾心ELISA檢測Vκ4-1-Jκ3型Ig體系建立本章工作的主要目的是建立雙單抗夾心ELISA檢測體系，并以此檢

10、測正常人與腫瘤患者可溶性Vκ4-1-Jκ3型Ig水平及表達規(guī)律。本課題組前期工作建立單多抗夾心ELISA檢測體系(1A3-標準血清-HRP-IgA，1A3-標準血清-HRP-IgG和1A3-標血清-HRP-IgM)檢測顯示正常人血清與腫瘤患者血清Vκ4-1-Jκ3型Ig含量有明顯差別，表現(xiàn)為腫瘤患者血清中可溶性Vκ4-1-Jκ3型IgA與IgG含量顯著高于正常人;而Vκ4-1-Jκ3型IgM明顯低于正常人。在此基礎(chǔ)上，我們嘗試建立雙單抗

11、夾心ELISA體系檢測可溶性Vκ4-1-Jκ3型Ig，結(jié)果顯示雙單抗夾心ELISA體系可特異性結(jié)合標準品融合重組蛋白GST-Vκ4-1-Jκ3，不能結(jié)合正常人血清與腫瘤血清Vκ4-1-Jκ3型Ig，未檢測血清與腫瘤病人血清Vκ4-1-Jκ3型Ig總量表達存在有差異。因此不能用此體系檢測腫瘤血清與正常血清Vκ4-1-Jκ3型Ig總量。
　　第二部分 ECDI交聯(lián)的人脾淋巴細胞誘導(dǎo)供者特異性耐受的體系初步建立
　　ECDI即1-

12、（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺(1-ethyl-3-(3'-dimethylaminopropyl)-carbodiimide），是一種易潮濕、水溶性的化學(xué)藥物，廣泛應(yīng)用于肽的合成。ECDI與肽和蛋白的偶聯(lián)主要是通過激活游離的羧基，促使激活的羧基與亞胺形成共價肽。1979年Miller等首次提出ECDI聯(lián)合抗原遞呈細胞APC具有誘導(dǎo)耐受的潛力并證實ECDI-APC會誘使效應(yīng)T細胞無能以及抗原特異性無反應(yīng)性。ECDI偶聯(lián)抗原在某些

13、在某些自身免疫性疾病如多發(fā)性硬化，自身免疫性糖尿病，實驗性自身免疫性腦脊髓炎可誘導(dǎo)自身免疫耐受。
　　如何在移植患者體內(nèi)誘導(dǎo)供者特異性免疫耐受，從而最終避免排斥反應(yīng)，停用，甚至不用免疫抑制藥物是移植學(xué)研究的重要目標之一。誘導(dǎo)供者特異性免疫耐受的策略之一是在移植前將供者抗原暴露于受體。此類暴露方法的最關(guān)鍵之處是確定暴露的具體條件，以確保誘導(dǎo)受體耐受而不是引起受體致敏。這種類似于“幼兒計劃免疫接種”的方法自從1980年代以來進行了多次

14、實驗，終因產(chǎn)生致敏和促血栓形成等多種因素被排除在臨床應(yīng)用之外。近期，有學(xué)者通過應(yīng)用一種ECDI把自身免疫疾病相關(guān)的肽或蛋白交聯(lián)到脾細胞，并輸注至自身免疫疾病動物模型，成功在實驗性自身免疫性腦炎(EAE)和自身免疫性糖尿病(T1D)模型誘導(dǎo)抗原耐受。
　　Xunrong Luo首次把這種策略轉(zhuǎn)換到移植耐受領(lǐng)域，通過輸注ECDI處理的供者脾細胞(ECDI-SPs)，在MHC完全錯配的小鼠胰島移植中成功誘導(dǎo)胰島移植物的無限期存活。該研究

15、方案基于完全不用免疫抑制劑，不需要短暫細胞刪除、抗體介導(dǎo)的共刺激信號阻斷、或移植前應(yīng)用免疫抑制藥物等措施。進一步研究顯示ECDI-SPs輸注通過多種機制來影響宿主異基因反應(yīng)，包括克隆清除、無能和免疫調(diào)節(jié)，這些機制通過協(xié)同作用來誘導(dǎo)高效的移植免疫耐受。除在小鼠同種異體和異種異體的胰島細胞移植模型中觀察到ECDI-SPs可誘導(dǎo)長期移植耐受，并且，在輸注前刪除B細胞可有效誘導(dǎo)出異種胰島移植物的無限期存活。研究還顯示ECDI-SPs可顯著延長在

16、MHC完全錯配的心臟移植物的存活，并且，短期應(yīng)用雷帕霉素(rapamycin)可誘導(dǎo)受體心臟移植物無限期存活。
　　目前工作擬在前期研究工作的基礎(chǔ)上，通過體外混合淋巴細胞實驗，與輸注人類脾淋巴細胞至NOD-SCID小鼠（即重癥聯(lián)合免疫缺陷小鼠，T和B細胞缺陷）建立人源化小鼠模型進行ECDI-SPs體內(nèi)實驗闡明ECDI-SPs誘導(dǎo)下人淋巴細胞各亞群異基因反應(yīng)性的動態(tài)變化規(guī)律和機制;研究模擬同種異基因移植環(huán)境下，人類ECDI-SPs誘

17、導(dǎo)人淋巴細胞抗原特異性免疫耐受的效果，深入探討針對供者特異性免疫耐受機制。
　　ECDI-SPs誘導(dǎo)供者特異性耐受體系的建立
　　初步研究人類ECDI-SPs誘導(dǎo)異基因T淋巴細胞各亞群的活化、增殖、凋亡的動態(tài)變化規(guī)律主要采用混合淋巴細胞實驗進行流式檢測觀察ECDI-SPs在體外對受者淋巴細胞的影響，包括增殖，抑制增殖與凋亡的變化規(guī)律。研究結(jié)果顯示ECDI-SPs誘導(dǎo)方案顯示可特異性抑制T細胞亞群的增殖。ECDI可誘導(dǎo)其處理的