線蟲神經(jīng)元特異性表達(dá)體系的建立與應(yīng)用.pdf

1、線蟲作為一種重要的模式生物,具有結(jié)構(gòu)簡單,生命周期短,繁殖能力強等特點而被用于神經(jīng)生物學(xué)研究。其神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)簡單,可分為運動神經(jīng)元、感覺神經(jīng)元、中間神經(jīng)元等幾大類。線蟲神經(jīng)功能研究中,通常進(jìn)行特異性表達(dá)或標(biāo)記神經(jīng)元以進(jìn)行針對性的研究。然而,線蟲中能被特異性標(biāo)記的神經(jīng)元和標(biāo)記方法都較少,且需要繁復(fù)的人力勞動進(jìn)行載體構(gòu)建。本研究以解決這些問題為基本出發(fā)點。
　　本研究將線蟲單神經(jīng)元表達(dá)的啟動子構(gòu)建成MultisiteGateway體系

2、的第一個入門克隆形式,以便于高效準(zhǔn)確的進(jìn)行表達(dá)克隆構(gòu)建。在進(jìn)行大片段DNA序列的BP反應(yīng)時,效率不高,但經(jīng)濟(jì)成本高昂。為解決這個問題,引進(jìn)In-fusion技術(shù),將神經(jīng)元特異性表達(dá)的啟動子構(gòu)建形成入門克隆庫。如此,單神經(jīng)元特異性表達(dá)啟動子便可以與任意基因組合構(gòu)建表達(dá)載體,實現(xiàn)了較強的通用性。通過連接破傷風(fēng)桿菌神經(jīng)毒素TeTx、線蟲基因、熒光蛋白等基因組成表達(dá)載體的方法,對這些啟動子進(jìn)行了表達(dá)驗證,同時對標(biāo)記相同神經(jīng)元的啟動子進(jìn)行了比較。

3、然而,線蟲中能被單啟動子驅(qū)動特異性表達(dá)標(biāo)記的神經(jīng)元數(shù)量有限,被證實不足20個。運用位點特異性重組酶Flp/Frt、Cre/LoxP系統(tǒng)結(jié)合Gateway技術(shù)可實現(xiàn)多啟動子重疊表達(dá)神經(jīng)元的標(biāo)記。為實現(xiàn)多順反子在線蟲相同組織同時表達(dá),線蟲中第二種反式剪接的splicedleader(SL2)被應(yīng)用了進(jìn)來。SL2e連接熒光蛋白,對其介導(dǎo)的多順反子表達(dá)效果進(jìn)行了激光掃描共聚焦成像分析。
　　建立的這套神經(jīng)元特異性表達(dá)體系可便捷地應(yīng)用于線蟲