MHE對P糖蛋白底物體內(nèi)行為的影響及作用物質(zhì)基礎(chǔ)初探.pdf

1、目的：
　　醋柴胡小分子水溶性部位（micromolecular hydrophilic extract from vinegar baked Radix Bupleuri，MHE）是醋柴胡水提液經(jīng)80％醇沉去掉多糖和正丁醇萃取后的水溶性部位，前期實驗證明其是疏肝解郁的有效部位，體外實驗中證明其可抑制P糖蛋白的基因表達(dá)和蛋白表達(dá)，提高Pgp-HEK293細(xì)胞對底物的攝取。本文將探討MHE對P糖蛋白引起的多藥耐藥和藥物相互作用的影響

2、，并初步鑒定MHE中所含有的成分。
　　方法：
　　1.采用耐藥細(xì)胞模型考察MHE逆轉(zhuǎn)因P糖蛋白導(dǎo)致的多藥耐藥現(xiàn)象。利用MTT法考察受試藥物MHE、維拉帕米對MES-SA和宮頸癌耐藥細(xì)胞株MES-SA/MX2細(xì)胞的毒性影響，獲得安全給藥范圍；考察MHE聯(lián)用阿霉素對MES-SA/MX2的毒性影響，確定MHE的逆轉(zhuǎn)倍數(shù)。采用流式細(xì)胞術(shù)考察MHE對P糖蛋白底物羅丹明123的蓄積的影響，探討其體外對于P糖蛋白活性影響。
　　2

3、.藥物動力學(xué)方法考察MHE對P糖蛋白底物地高辛體內(nèi)行為的影響。首先考察不同劑量組MHE對地高辛藥物動力學(xué)的影響，大鼠灌胃給藥后分別于給定時間點采血，測定其中藥物濃度，比較聯(lián)用MHE后地高辛藥動學(xué)參數(shù)的變化。其次考察MHE對地高辛體內(nèi)分布的影響。大鼠給予藥物后，于給定時間點處死，收集臟器，測定其中藥物濃度，比較聯(lián)用前后地高辛組織內(nèi)藥物濃度的變化。
　　3.通過考察組織內(nèi)轉(zhuǎn)運蛋白表達(dá)探討MHE影響地高辛體內(nèi)過程的機(jī)制。實時熒光定量PC

4、R測定大鼠地高辛5 min，15 min，3 h單用組和聯(lián)用組的肝、腎、小腸、心的P糖蛋白和Oatp2的mRNA相對表達(dá)量，并比較其差異。
　　4.MHE影響地高辛體內(nèi)行為的物質(zhì)基礎(chǔ)通過對其中成分進(jìn)行分析進(jìn)行初步探討。其中利用三甲基硅烷衍生化GC-MS測定其中糖類等成分，利用AQC衍生化HPLC-UV鑒定MHE游離氨基酸種類。
　　結(jié)果：
　　1.MHE、維拉帕米的安全給藥范圍分別為50 mg/mL生藥濃度和10μM；

5、1 mg/mL，10 mg/mL生藥濃度的MHE和1μM維拉帕米對MES-SA/MX2細(xì)胞的逆轉(zhuǎn)倍數(shù)分別為0.23，0.42，9.49。相比對照組，不同劑量的MHE對Rh123的相對攝取率均沒有顯著影響。
　　2.地高辛線性范圍為0.156~50 ng/mL，提取回收率為70.19~98.99%、基質(zhì)效應(yīng)為96.08~114.2%、準(zhǔn)確度范圍為85.7~114.3%，內(nèi)日間精密度RSD小于15%，穩(wěn)定性RSD小于15%。與單用組相

6、比，低劑量聯(lián)用組地高辛的AUC(0-t)，AUC(0-∞)，MRT(0-t)分別降低了31.54%，24.92%，24.42%（P<0.05），CLz/F增加了29.60%；高劑量聯(lián)用組地高辛的AUC(0-t)，AUC(0-∞)，MRT(0-t)的分別降低了42.98%（P<0.01），36.31%（P<0.01），21.81%（P<0.05），CLz/F增加了59.02%（P<0.05）。MHE顯著改變地高辛的體內(nèi)分布，增加其在肝臟的

7、分布，減少其在小腸和血液中的分布，不影響心、腎藥物濃度。肝臟的相對攝取率RUE增加14.1%，小腸和血漿的RUE分別降低58.1%和36.5%，心、腎的RUE幾乎不變；肝臟、腎、心的相對攝取率RTE分別為76.9%，57.1%，52.6%，小腸的RTE為-35.0%。
　　3.與單用組相比，聯(lián)用組的肝臟P糖蛋白mRNA的表達(dá)量在5 min時顯著下降（P<0.05）；而Oatp2的mRNA的表達(dá)量在3h時上升（P<0.05）。腎臟P

8、糖蛋白 mRNA的表達(dá)量在5 min，15 min時顯著下降（P<0.05），Oatp2 mRNA的表達(dá)量在3h時顯著降低（P<0.05）。小腸P糖蛋白mRNA在3h時顯著提高，P<0.05。其余臟器和時間點的P糖蛋白和Oatp2的表達(dá)均沒有顯著性差異。
　　4.MHE主要含有5種寡糖：蔗糖、麥芽糖、乳糖、甘露二糖、龍膽二糖；10種單糖（含糖醇和醛酸）：木糖醇、山梨糖、D-葡萄糖、D-甘露糖、D-葡萄糖醛酸、D-果糖、D-甘露醇、

9、景天庚酮糖、D-阿拉伯吡喃糖、D-核糖；5種有機(jī)酸：琥珀酸、醋酸、丙二酸、丁二酸、延胡索酸；其余：十六烷醇、肌醇、順式-13-十八烯酸、11-順式-十八烯酸、反式-9-十八烯酸、十八烷酸、且含有18種合成人體蛋白質(zhì)的氨基酸和γ-氨基丁酸。
　　結(jié)論：
　　在體外實驗中MHE并不能逆轉(zhuǎn)MES-SA/MX2細(xì)胞株上基于P糖蛋白的耐藥現(xiàn)象，然而在體內(nèi)藥物動力學(xué)以及體內(nèi)分布實驗顯示MHE顯著影響了P糖蛋白底物地高辛的藥物動力學(xué)行為以