炎性細(xì)胞因子對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞PAPP-A、VEGF、ICAM-1蛋白分泌的影響.pdf

1、急性冠脈綜合征（acute coronary syndrome，ACS）目前仍然是引起冠心病死亡的最主要病因，它嚴(yán)重威脅人類的生命健康。ACS是包括不穩(wěn)定型心絞痛（unstable angina pectoris，UAP）、急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）和急性缺血性心源性猝死（sudden cardiogenic death，SCD）在內(nèi)的一組臨床綜合征。由于上述三種臨床類型都有突然發(fā)病的

2、特點(diǎn)，使人們想到其發(fā)病機(jī)制可能有共同的病理生理基礎(chǔ)。目前認(rèn)為其發(fā)病機(jī)制主要是與中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞粘附到血管內(nèi)皮細(xì)胞觸發(fā)炎癥反應(yīng)及氧化低密度脂蛋白沉積，冠狀動(dòng)脈不穩(wěn)定粥樣斑塊形成有關(guān)。 冠狀動(dòng)脈粥樣硬化（artherosclerosis，AS）不穩(wěn)定斑塊的破裂、血小板的聚集及血栓形成造成冠脈急性狹窄或閉塞是導(dǎo)致ACS的重要原因。目前研究認(rèn)為，AS是對(duì)局部損傷的一種保護(hù)性炎癥-纖維增殖性回應(yīng)，這種回應(yīng)一旦變得過度，最終導(dǎo)致粥樣斑塊

3、形成。炎癥貫穿了AS的始終，而由炎癥引起的內(nèi)皮細(xì)胞損傷及其功能減退是AS發(fā)生、發(fā)展最重要的始動(dòng)因素；參與AS形成的炎癥因子有很多，其中白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）不僅可以損傷內(nèi)皮功能及削弱內(nèi)皮對(duì)舒血管物質(zhì)的反應(yīng)，而且誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生單核細(xì)胞趨化蛋白（monocyte chemoattractant protein-1，MC

4、P-1），后者在趨化單核細(xì)胞黏附冠狀動(dòng)脈內(nèi)膜參與粥樣斑塊的形成發(fā)揮著重要的作用；而單核細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞相互黏附可進(jìn)一步促進(jìn)MCP-1、TNF-α、IL-1β、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（Granulocyte-macrophage colony stimutaing factor，GM-CSF）等細(xì)胞因子的表達(dá)，進(jìn)而激活單核-巨噬細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞遷移至局部粥樣斑塊中形成泡沫細(xì)胞。有研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)TNF-α、IL-1β等細(xì)胞因子一方面

5、可以誘導(dǎo)平滑肌細(xì)胞的凋亡，由于大量平滑肌細(xì)胞凋亡使斑塊肩部無法發(fā)揮支撐作用，不能維持斑塊的組織結(jié)構(gòu)，使斑塊不穩(wěn)定而易于破裂。另一方面粥樣斑塊中的TNF-α，和IL-1β還可以促使巨噬細(xì)胞分泌基質(zhì)金屬蛋白酶（Matrix metalloproteinase，MMPs），加快粥樣斑塊細(xì)胞外基質(zhì)的溶解，最終導(dǎo)致斑塊的破裂。目前已經(jīng)證實(shí)：ACS的發(fā)生與斑塊的不穩(wěn)定性密切相關(guān)，導(dǎo)致斑塊不穩(wěn)定的因素包括炎癥反應(yīng)的過度激活、斑塊基質(zhì)的降解、凝血機(jī)制的

6、變化等，其中炎癥反應(yīng)在易損斑塊（vulnerable plaque，VP）的發(fā)生、演變以及斑塊破裂過程中自始至終都起著至關(guān)重要的作用。VP含有大量的巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞等炎性細(xì)胞，它們大量分泌如IL-1β、IL-6和TNF-α等炎性細(xì)胞因子，參與ACS的病理過程。 隨著對(duì)VP研究的深入發(fā)現(xiàn)，除了TNF-α、IL-1β等促炎癥因子，一系列斑塊穩(wěn)定性相關(guān)血清活性物質(zhì)對(duì)斑塊的衍變也有重要影響。妊娠相關(guān)血漿蛋白A（pregnancy as

7、sociated plasma protein-A，PAPP-A）是新近發(fā)現(xiàn)的與斑塊穩(wěn)定性密切相關(guān)的一種MMPs，它可通過多個(gè)渠道參與ACS的病理過程。作為MMPs一員，推測(cè)PAPP-A可能是炎癥因子或其它冠心病的危險(xiǎn)因素作用于單核/巨噬細(xì)胞或血管平滑肌細(xì)胞釋放的一種物質(zhì)，該物可能同樣具有消解粥樣斑塊的纖維帽作用；PAPP-A也可能通過胰島素樣生長(zhǎng)因子（insulin-like growth factor-1，IGF-1）作用引起炎性細(xì)

8、胞因子釋放及炎癥細(xì)胞激活而引起動(dòng)脈粥樣斑塊的不穩(wěn)定。除了炎癥，斑塊內(nèi)血管生成在AS發(fā)生、發(fā)展及其相關(guān)的臨床綜合征的發(fā)生、發(fā)展中也發(fā)揮著重要的作用。導(dǎo)致斑塊內(nèi)血管生成的機(jī)制與因素目前尚不清楚，也是目前研究的熱點(diǎn)。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是目前所發(fā)現(xiàn)的唯一特異性促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂的生長(zhǎng)因子，具有特異性促進(jìn)血管新生之作用，而血管新生又可促進(jìn)AS之進(jìn)程，使薄壁的滋養(yǎng)

9、血管很容易破裂，造成斑塊內(nèi)出血，進(jìn)而形成血栓引發(fā)UAP、MI等嚴(yán)重心血管事件。越來越多的證據(jù)表明，VEGF對(duì)AS的進(jìn)展和斑塊不穩(wěn)定性有密切關(guān)系，VEGF可通過炎癥浸潤(rùn)和促進(jìn)新生血管形成等機(jī)制促進(jìn)粥樣硬化損傷的進(jìn)展。細(xì)胞間黏附分子-1（intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1）介導(dǎo)的白細(xì)胞的黏附增加可促進(jìn)斑塊的不穩(wěn)定，削弱斑塊處的纖維帽，加速斑塊裂隙，最終促進(jìn)斑塊破裂，血栓形成，臨床表現(xiàn)為UAP和A

10、MI的發(fā)生。新生血管內(nèi)皮上常有高水平的ICAM-1，這些高表達(dá)的粘附分子是單核-巨噬細(xì)胞向病變部位遷移的重要的調(diào)節(jié)因素，從而形成了一個(gè)促進(jìn)病變部位血管發(fā)生的正反饋調(diào)節(jié)機(jī)制。 因此，冠狀動(dòng)脈粥樣斑塊中產(chǎn)生的多種細(xì)胞因子互相誘導(dǎo)、互相協(xié)作，形成了復(fù)雜的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)，最終促進(jìn)了不穩(wěn)定脈粥樣斑塊的形成。更為重要的是通過國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，炎性細(xì)胞因子和一系列斑塊穩(wěn)定性相關(guān)的血清活性物質(zhì)有著密切的關(guān)系：上述血清活性物質(zhì)物的表達(dá)受炎性細(xì)胞因子的

11、調(diào)節(jié)而參與炎癥反應(yīng)，但是這些研究主要集中在在人成骨細(xì)胞、人皮成纖維細(xì)胞中；而針對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cell，HUVEC）的報(bào)道較少。本研究以上述研究為參考和基礎(chǔ)，分析炎性細(xì)胞因子在蛋白分泌水平上對(duì)HUVEC表達(dá)上述血清活性物質(zhì)的影響，以進(jìn)一步探討ACS中炎癥與血清活性物質(zhì)的相互關(guān)系和作用機(jī)制及VEGF與PAPP-A之間的相關(guān)性，從而揭示AS發(fā)生機(jī)制，為ACS的防治提供重要

12、的靶點(diǎn)。 目的： 研究炎性細(xì)胞因子IL-1β和TNF-α對(duì)HUVEC中PAPP-A、VEGF、ICAM-1蛋白表達(dá)的影響以及PAPP-A與VEGF之間的相互關(guān)系，進(jìn)一步探討炎癥因素及新生血管形成在ACS中的作用機(jī)制。 方法： HUVEC在37℃，95％空氣和5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，傳至3-5代后，將細(xì)胞按1×105/c㎡密度接種于5c㎡培養(yǎng)皿中。24小時(shí)后換液，在細(xì)胞接近80％融合時(shí)加入不同干預(yù)因子進(jìn)行刺

13、激；根據(jù)不同干預(yù)因素分成兩大組：1、對(duì)照組、SU5416組、IL-1β組、IL-1 β+SU5416組、TNF-a組、TNF-a+SU5416組、IL-1β+TNF-α組、IL-1β+TNF-a+SU5416組；2、對(duì)照組、PAPP-A受體阻斷劑組、IL-1β組、IL-1β+PAPP-A受體阻斷劑組、TNF-a組、TNF-a+PAPP-A受體阻斷劑組、IL-1β+TNF-α組、IL-1β+TNF-a+PAPP-A受體阻斷劑組：每孔培養(yǎng)液

14、均為1ml，IL-1β、TNF-α終濃度為10ng/ml，PAPP-A受體阻斷劑終濃度為20uM，F(xiàn)lk-1（VEGF受體）特異性阻斷劑SU5416終濃度為1μmol/L，在共同培養(yǎng)24h后收集細(xì)胞培養(yǎng)液上清，上清液-70℃凍存待統(tǒng)一測(cè)定，應(yīng)用ELISA方法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液內(nèi)PAPP-A、VEGF、ICAM-1的蛋白表達(dá)量。所得數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 13.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)描述與分析，計(jì)量資料用x±s表示，數(shù)據(jù)分析使用的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法有析因設(shè)

15、計(jì)資料的方差分析（two-way classification ANOVA）、多個(gè)獨(dú)立樣本的非參數(shù)檢驗(yàn)（K Independent Samples Test），兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)（其中，方差不齊的組采用的是Welch-Satterthwaite approximate t test）；p<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)論： 1、炎性細(xì)胞因子IL-1β、TNF-α能促進(jìn)HUVEC斑塊穩(wěn)定相關(guān)血清活性物質(zhì)PAPP-A、VEG

16、F、ICAM-1的蛋白分泌，說明炎性細(xì)胞因子和炎癥反應(yīng)可能對(duì)HUVEC上述血清活性物質(zhì)的旁分泌起著調(diào)節(jié)作用。 2、炎性細(xì)胞因子IL-1β、TNF-α、IL-1β+TNF-α對(duì)PAPP-A、VEGF的促分泌作用相同，同時(shí)使用炎性因子與VEGF受體阻斷劑干預(yù)后PAPP-A的分泌明顯低于炎性因子單獨(dú)干預(yù)組，而使用炎性因子與PAPP-A受體阻斷劑干預(yù)后VEGF的分泌也明顯低于炎性因子單獨(dú)干預(yù)組，說明PAPP-A與VEGF之間具有一定的相