補陽還五湯對肺纖維化中誘導免疫損傷的HMGB1的干預作用研究.pdf

1、肺纖維化（Pulmonary Fibrosis，PF）是以肺實質破壞、纖維斑痕和成纖維細胞灶形成、細胞外基質過度沉積為特征的纖維增殖性疾病。多種間質性肺疾?。↖nterstitial Lung Disease,ILD）在晚期均可發(fā)展為彌漫性肺纖維化，其中特發(fā)性肺纖維化（Idiopathic Pulmonary Fibrosis，IPF）最常見。IPF的病因和發(fā)病機制尚不清楚，缺乏有效治療手段。最近的證據(jù)表明，重要的晚期炎癥因子高遷移率族

2、蛋白B1（HighMobilityGroupBox1protein，HMGB1），能在細胞核內作為α平滑肌動蛋白(Alpha-Smooth Muscle Action，α-SMA)基因的轉錄活化因子誘導上皮細胞發(fā)生間質轉化（Epithelial Mesenchymal Transition，EMT），成為肺纖維化成纖維細胞灶中肌成纖維細胞的重要來源。在細胞外能啟動絲裂原活化蛋白激酶（Mitogen-Activated Protein K

3、inases，MAPKs）、核因子κB（Nuclear Factor kappa B，NF-κB）等多條信號通路，激活免疫炎癥和異常修復。根據(jù)IPF的臨床特征和病機變化特點，在祖國醫(yī)學中歸屬于“肺痿”、“肺痹”等疾病范疇，病位在肺、腎，屬本虛標實之證。病因為外邪侵襲、久病傷肺、素體氣虛等，產生痰濁、瘀血、熱毒等病理產物，引起肺腎虧虛、氣虛血瘀、痹阻肺絡等病機改變，治療應以益氣活血通絡、祛痰滋陰溫陽為重點。
　　目的：
　　本

4、研究以HMGB1為靶點，以人肺成纖維細胞（HFL1）、人非小細胞肺癌細胞（A549）和博萊霉素致纖維化大鼠為受試對象，從氣虛血瘀的核心病機入手，結合血清藥理學，采用益氣活血通絡的“補陽還五湯”在體內外共同干預的方法，探討補陽還五湯治療肺纖維化的分子機制。
　　方法：
　　1.不同濃度補陽還五湯含藥血清對HMGB1刺激HFL1、A549后，細胞中α-SMA、細胞外調節(jié)蛋白激酶1/2（Extracellular Regulate

5、d Protein Kinase1/2，ERK1/2）、NF-κBp65等蛋白表達的干預作用
　　首先采用MTT法和ELISA法檢測0、10、50、100、500ng/ml的HMGB1對HFL1、A549細胞增殖和IL-6的影響。根據(jù)結果選擇最佳濃度的HMGB1作為誘導劑量刺激HFL1、A549細胞，使用5％、10%、15%、20%不同濃度的補陽還五湯含藥血清進行干預，作用24h后提取細胞蛋白，通過Western blot方法檢測

6、補陽還五湯含藥血清在體外對α-SMA、ERK1/2、NF-κBp65等蛋白表達的影響。通過ELISA法檢測細胞培養(yǎng)上清中IL-6、IL-1β等細胞因子的變化。
　　2.最佳濃度補陽還五湯含藥血清對HMBG1刺激HFL1、A549后不同時間點α-SMA、ERK1/2、p-ERK1/2、信號傳導及轉錄活化因子3（Signal Transducers and Activators of Transcription3，STAT3）、p-S

7、TAT3等蛋白的影響
　　根據(jù)實驗一選擇最佳濃度的含藥血清，預刺激HFL1、A549細胞0.5h后加入HMGB1共同刺激，于0、6、24、72h提取細胞總蛋白，Western blot法檢測補陽還五湯含藥血清在不同時間對α-SMA、ERK1/2、p-ERK1/2、STAT3、p-STAT3等蛋白表達的影響。
　　3.補陽還五湯對肺纖維化大鼠肺內HMGB1及晚期糖基化終產物受體（Receptor of Advanced Gly

8、cation End-product，RAGE）的干預作用
　　采用博萊霉素氣管滴注法復制肺纖維化模型，在7天、14天、28天分三批采集肺組織。取左肺固定于4%多聚甲醛中，通過HE染色、Masson染色檢測模型復制結果。右肺勻漿，分別提取RNA和蛋白，通過PCR法檢測補陽還五湯在動物體內對HMGB1mRNA、RAGE mRNA表達的影響、Western blot法檢測HMGB1、α-SMA蛋白的表達情況。
　　結果：

9、　　1.MTT及ELISA結果顯示，100ng/ml的HMGB1對細胞增殖和IL-6分泌的促進作用最明顯，與空白對照組比較P<0.01。使用不同濃度的補陽還五湯含藥血清干預HFL1、A549細胞0.5h，加入100ng/ml的HMGB1作為誘導劑共同刺激24h后，細胞內蛋白表達結果顯示HMGB1可刺激HFL1、A549細胞中α-SMA表達增加，與空白對照組比較P<0.01。補陽還五湯含藥血清可降低兩種細胞內α-SMA的表達，其中20%含

10、藥血清組與HMGB1刺激組比較P<0.01。HMGB1（100ng/ml）刺激24h后HFL1、A549細胞內ERK1/2表達增加，在HFL1中上升趨勢更明顯。補陽還五湯含藥血清可降低HFL1、A549細胞內ERK1/2的表達，20%含藥血清組與HMGB1刺激組比較P<0.01。HMGB1（100ng/ml）刺激24h后HFL1、A549細胞漿和細胞核中NF-κBp65的表達增加，其中HFL1細胞核中NF-κBp65的表達量高于胞漿，A

11、549細胞漿中NF-κBp65的表達量高于胞核。補陽還五湯含藥血清可降低兩種細胞胞核中NF-κBp65的表達，在HFL1細胞中，20%含藥血清與HMGB1刺激組比較P<0.05，在A549細胞中15%含藥血清組與HMGB1刺激組比較P<0.01。HMGB1（100ng/ml）刺激24h后HFL1、A549培養(yǎng)上清中IL-6和IL-1β表達增加，使用補陽還五湯含藥血清干預后可降低IL-1β的表達，增加IL-6的表達，以20%含藥血清組效果

12、最佳，與HMGB1刺激組比較結果具有顯著性差異。
　　2.采用HMGB1（100ng/ml）刺激后A549細胞中α-SMA、ERK1/2、STAT3、p-STAT3表達升高，與空白對照組比較P<0.01，p-ERK1/2增高不明顯。α-SMA從0小時持續(xù)升高至24小時，ERK1/2在72h達高峰。使用20%補陽還五湯含藥血清干預后，可明顯抑制α-SMA、ERK1/2、STAT3、p-STAT3的表達，促進p-ERK1/2的表達，差

13、異具有統(tǒng)計學意義。
　　使用HMGB1（100ng/ml）刺激HFL1后，細胞中α-SMA、ERK1/2、p-ERK1/2、STAT3、p-STAT3表達均升高，與空白對照組比較P<0.01。α-SMA、ERK1/2在72小時升高最明顯，p-ERK1/2從0h持續(xù)增高到72h。使用20%補陽還五湯含藥血清干預后，可降低α-SMA、ERK1/2、p-ERK1/2、STAT3、p-STAT3的表達，差異具有統(tǒng)計學意義。
　　3.

14、采用博萊霉素氣管滴注后，模型組大鼠肺臟出現(xiàn)典型纖維化改變，HE和Masson結果顯示在7天至28天的時間中，肺泡炎呈逐漸減輕趨勢，纖維化呈逐漸增加趨勢，結合Szapiel分級評分標準判斷肺纖維化動物模型復制成功。肺纖維化模型組大鼠肺組織中HMGB1mRNA、RAGE mRNA及HMGB1、α-SMA蛋白表達均增加。HMGB1mRNA及HMGB1、α-SMA蛋白呈逐漸遞增趨勢，在第28天達高峰，結果具有統(tǒng)計學差異。RAGE mRNA呈逐漸

15、下降趨勢，在第7天達高峰后持續(xù)下降，但各時間點與空白組比較均有顯著性差異，P<0.01。使用不同劑量的補陽還五湯干預后，可不同程度降低HMGB1mRNA、RAGEmRNA及HMGB1、α-SMA蛋白表達，以補陽還五湯高劑量組效果最佳，與模型組比較P<0.01。
　　結論：
　　補陽還五湯可有效抑制纖維化大鼠肺組織中HMGB1、RAGE和α-SMA的表達并可在體外阻斷HMGB1所激活的多個與炎癥和纖維化相關的信號通路，減輕免疫