補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)博萊霉素所致大鼠特發(fā)性肺纖維化的保護(hù)作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　基于促纖維化生成的關(guān)鍵介質(zhì)HMGB1探討補(bǔ)陽(yáng)還五湯治療博來(lái)霉素致大鼠特發(fā)性肺纖維化藥效學(xué)作用機(jī)制。
　　方法：
　　1.采用體重200±20g的SD雄性大鼠144只隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型組、強(qiáng)的松組、補(bǔ)陽(yáng)還五湯高、中、低劑量組，每組24只。除空白組外其余各組均采用一次性氣管注射博來(lái)霉素法誘導(dǎo)肺纖維化模型。造模后24h給予相應(yīng)藥物，各組分別于第7、14、28天隨機(jī)抽取8只大鼠進(jìn)行股動(dòng)脈放血處死，收集支氣管肺

2、泡灌洗液（Broncho alveolar fluid，BALF）和肺組織，采用HE、Masson染色法觀察肺組織肺泡炎、纖維化程度，酶聯(lián)免疫法（ELISA法）檢測(cè)肺泡灌洗液中早期炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6和晚期炎性因子HMGB1的水平，逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR法）檢測(cè)肺組織HMGB1、TLR2mRNA的表達(dá)，Western-blot法檢測(cè)肺組織中HMGB1、α-SMA的含量，免疫組化染色法（鏈霉素親和素一過(guò)氧化物

3、酶，SABC法）檢測(cè)肺組織切片HMGB1、α-SMA蛋白的分布及表達(dá)。2.從中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心購(gòu)置A549，培養(yǎng)傳至第三代后分別根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要種于不同的培養(yǎng)皿中，收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。加入以DMEM/F12培養(yǎng)液稀釋的補(bǔ)陽(yáng)還五湯溶液，加入HMGB1蛋白刺激培養(yǎng)24h收獲上清，分裝后予-80℃凍存?zhèn)溆?；條件一致，加入以DMEM/F12培養(yǎng)液稀釋的補(bǔ)陽(yáng)還五湯溶液，加入HMGB1蛋白分別于刺激0、6、24、72h提取

4、細(xì)胞總蛋白。Western-blot法檢測(cè)A549細(xì)胞蛋白中STAT3、P-STAT3的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1.一般情況：空白組大鼠形體壯碩，反應(yīng)靈敏，皮毛光滑柔順，食量正常。模型組大鼠表現(xiàn)出精神萎靡，眼光呆滯，反應(yīng)遲鈍，呼吸喘促，個(gè)別口鼻出現(xiàn)紅色分泌物，少動(dòng)，皮毛干枯無(wú)光澤，弓背蜷縮，進(jìn)食量較正常組減少，體重增長(zhǎng)緩慢。其余各給藥組大鼠精神較好，反應(yīng)較為靈敏，呼吸較平穩(wěn)，皮毛光澤度良好。隨時(shí)間的推進(jìn)，活動(dòng)量、進(jìn)食量下降等

5、程度均有不同程度的改善。
　　2.病理形態(tài)學(xué)：①HE染色：空白對(duì)照組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)清晰，未見明顯形態(tài)學(xué)改變；與空白對(duì)照組相比，模型組大鼠的肺泡結(jié)構(gòu)均有不同程度的破壞，有炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)和膠原纖維的增生；與模型組相比，各給藥組的肺泡炎及肺纖維化程度在不同時(shí)間點(diǎn)均有不同程度的改善。②Masson染色空白組組大鼠支氣管壁膠原層較薄，肺泡區(qū)有少量染成淺藍(lán)色的膠原纖維分布。模型組大鼠第7d肺泡間明顯增寬，在支氣管壁、血管壁以及肺泡間隔均可見染

6、成藍(lán)色的膠原纖維；第14d各級(jí)支氣管及血管外壁、增厚的肺泡隔內(nèi)均可見藍(lán)色膠原纖維；第28d在細(xì)支氣管、低血管外膜和纖維化實(shí)變區(qū)可見大量藍(lán)色膠原纖維增生，彌漫性肺纖維化生成。強(qiáng)的松組與補(bǔ)陽(yáng)還五湯各劑量組均能減輕肺纖維化。
　　3.TNF-α、IL-1β、IL-6、HMGB1的含量：①TNF-α：與空白組比較，各時(shí)間點(diǎn)模型組大鼠肺泡灌洗液中（BALF）中TNF-α含量升高（P＜0.05）。在28天TNF-α含量下降，與7、14天比較差

7、異具有顯著性（P＜0.05）；與模型組比較，各時(shí)間點(diǎn)強(qiáng)的松組和補(bǔ)陽(yáng)還五湯高、中、低劑量組均降低大鼠肺泡灌洗液中（BALF）中TNF-α含量（P＜0.05）；與強(qiáng)的松組比較，第7、14天補(bǔ)陽(yáng)還五湯各劑量組有明顯差異（P＜0.05）；補(bǔ)陽(yáng)還五湯各劑量組之間比較，各時(shí)間點(diǎn)高劑量組與低、中劑量組之間有差異（P＜0.05）②IL-1β：與空白組比較，各時(shí)間點(diǎn)模型組大鼠肺泡灌洗液中（BALF）中IL-1β含量升高（P＜0.05）。其IL-1β含量呈

8、進(jìn)行性降低趨勢(shì)，實(shí)驗(yàn)的第7天達(dá)到高峰，以后逐漸下降，但仍然處于較高水平。與模型組比較，各時(shí)間點(diǎn)強(qiáng)的松組和補(bǔ)陽(yáng)還五湯高、中、低均降低大鼠肺泡灌洗液中（BALF）中IL-1β含量（P＜0.05）；與強(qiáng)的松組相比，第7天補(bǔ)陽(yáng)還五湯高、中、低劑量組具有顯著性差異（P＜0.05），與強(qiáng)的松組相比，第14、28天補(bǔ)陽(yáng)還五湯各劑量組無(wú)明顯差異（P＞0.05）。補(bǔ)陽(yáng)還五湯各劑量組之間無(wú)明顯差異（P＞0.05）③IL-6：空白組比較，模型組大鼠肺泡灌洗液

9、中（BALF）中IL-6含量升高（P＜0.05）。模型組各時(shí)間點(diǎn)比較，第14、28天與第7天比有差異（P＜0.05），其IL-6含量呈進(jìn)行性降低趨勢(shì)。與模型組比較，各時(shí)間點(diǎn)強(qiáng)的松組和補(bǔ)陽(yáng)還五湯高、中、低均降低大鼠肺泡灌洗液中（BALF）中IL-6含量（P＜0.05）；與強(qiáng)的松組相比，第7天高、中、低劑量組具有顯著性差異（P＜0.05）。第14、28天補(bǔ)陽(yáng)還五湯各劑量組無(wú)明顯差異（P＞0.05）。補(bǔ)陽(yáng)還五湯各劑量組之間比較無(wú)明顯差異（P＞

10、0.05）④HMGB1：與空白組比較，各時(shí)間點(diǎn)模型組大鼠肺泡灌洗液中（BALF）中HMGB1含量升高（P＜0.05），模型組各時(shí)間點(diǎn)之間比較，無(wú)明顯差異（P＞0.05）；與模型組比較，各時(shí)間點(diǎn)強(qiáng)的松組和補(bǔ)陽(yáng)還五湯高、中、低均降低大鼠肺泡灌洗液中（BALF）中HMGB1含量（P＜0.05）；與強(qiáng)的松組相比，在第7、14、28天補(bǔ)陽(yáng)還五湯各劑量組均有明顯差異（P＜0.05）。
　　4.HMGB1、α-SMA的表達(dá)：①HMGB1表達(dá)與空

11、白組比較，各時(shí)間點(diǎn)模型組大鼠肺組織HMGB1的表達(dá)升高（P＜0.01）。模型組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)比較，無(wú)明顯差異（P＞0.05）；與模型組比較，強(qiáng)的松組和補(bǔ)陽(yáng)還五湯高、中、低在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均降低肺組織HMGB1的過(guò)度表達(dá)（P＜0.05）；與強(qiáng)的松組相比，第7、14、28天補(bǔ)陽(yáng)還五湯各劑量組均有明顯差異（P＜0.05）。②α-SMA的表達(dá)與空白組比較，各時(shí)間點(diǎn)模型組大鼠肺組織α-SMA的表達(dá)升高（P＜0.01）。模型組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)比較無(wú)明顯差異（P＞

12、0.05）。與模型組比較，各時(shí)間點(diǎn)強(qiáng)的松組和補(bǔ)陽(yáng)還五湯高、中、低均降低肺組織α-SMA的過(guò)度表達(dá)（P＜0.05）；與強(qiáng)的松組相比，第28天補(bǔ)陽(yáng)還五湯各劑量組有明顯差異（P＜0.05）。
　　5.HMGB1、TLR2mRNA的表達(dá)：①HMGB1mRNA的表達(dá)空白組內(nèi)各時(shí)間點(diǎn)HMGB1mRNA的表達(dá)無(wú)明顯差異（P＞0.05），與空白組比較，各時(shí)間點(diǎn)模型組大鼠肺組織HMGB1mRNA的表達(dá)升高（P＜0.05），模型組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)比較，無(wú)明

13、顯差異（P＞0.05）；與模型組比較，各時(shí)間點(diǎn)強(qiáng)的松組和補(bǔ)陽(yáng)還五湯高、中、低均降低肺組織HMGB1mRNA的過(guò)度表達(dá)（P＜0.05）；與強(qiáng)的松組相比，在第14、28天補(bǔ)陽(yáng)還五湯各劑量組有明顯差異（P＜0.05）；②TLR2mRNA的表達(dá)空白組內(nèi)各時(shí)間點(diǎn)TLR2mRNA的表達(dá)無(wú)明顯差異（P＞0.05），與空白組比較，各時(shí)間點(diǎn)模型組大鼠肺組織TLR2mRNA的表達(dá)升高（P＜0.05）；模型組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)之間比較無(wú)明顯差異（P＞0.05）；與模

14、型組比較，強(qiáng)的松組和補(bǔ)陽(yáng)還五湯高、中、低均降低肺組織TLR2mRNA的過(guò)度表達(dá)（P＜0.05）；補(bǔ)陽(yáng)還五湯各劑量組與強(qiáng)的松組相比無(wú)明顯差異（P＞0.05）。
　　6.STAT3、P-STAT3的表達(dá)：與正常組比較，在HMGB1刺激下STAT3、P-STAT3的表達(dá)明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，20％補(bǔ)陽(yáng)還五湯含藥血清能夠抑制A549STAT3、P-STAT3的表達(dá)（P＜0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.補(bǔ)陽(yáng)還

15、五湯能夠改善BLM所致特發(fā)性肺纖維化大鼠的肺泡炎和肺纖維化瘢痕形成。
　　2.補(bǔ)陽(yáng)還五湯能夠降低BLM所致的特發(fā)性肺纖維化大鼠支氣管肺泡灌洗液炎性指標(biāo)TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、HMGB1的濃度值，這可能是其發(fā)揮抗IPF作用的機(jī)制之一。
　　3.補(bǔ)陽(yáng)還五湯能夠有效抑制肺組織HMGB1、TLR2mRNA的表達(dá)，補(bǔ)陽(yáng)還五湯能夠抑制肺組織HMGB1、α-SMA蛋白的表達(dá)，補(bǔ)陽(yáng)還五湯含藥血清能夠抑制STAT3、P-S