補陽還五湯對雪旺細(xì)胞氧化損傷保護(hù)作用機理的實驗研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、目的:長期以來,周圍神經(jīng)病變嚴(yán)重影響著人們的生活質(zhì)量,是神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域中的一個十分復(fù)雜的病變過程,近年來的研究發(fā)現(xiàn)其發(fā)病機理之一為氧化應(yīng)激引起氧自由基增多,從而導(dǎo)致雪旺細(xì)胞的凋亡。雪旺細(xì)胞是周圍神經(jīng)系統(tǒng)特有的一種膠質(zhì)細(xì)胞,能包繞軸突形成或不形成髓鞘,并分泌多種與神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和再生有密切關(guān)系的神經(jīng)因子。近些年來,應(yīng)用外界因素(如神經(jīng)生長因子、中藥、電磁場、硅膠管及其它物質(zhì)的移植等)通過對體內(nèi)雪旺細(xì)胞的作用進(jìn)而治療周圍神經(jīng)損傷的研究日漸增多

2、。 中藥對周圍神經(jīng)的作用,一直是我國醫(yī)療工作者和科研工作者研究的熱點,中藥促進(jìn)周圍神經(jīng)再生已經(jīng)得到人們的廣泛認(rèn)可。補陽還五湯是清代名醫(yī)王清任創(chuàng)制的補氣活血名方,由黃芪、赤芍、當(dāng)歸、地龍、川芎、桃仁和紅花組或,對于腦中風(fēng)等疾病有良好的治療效果,近年來此方用于治療周圍神經(jīng)病變,可改善、消除臨床癥狀?,F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明,它不僅具有擴張血管、增加腦血流量、改善微循環(huán)的作用,還有抗自由基氧化損傷作用。在我們以往的在體實驗研究中,已證實了補陽

3、還五湯能促進(jìn)坐骨神經(jīng)損傷后的結(jié)構(gòu)修復(fù)和功能恢復(fù),并且觀察到再生神經(jīng)有髓纖維多且結(jié)構(gòu)成熟,血管含量也比對照組明顯多,提示了補陽還五湯對雪旺細(xì)胞有一定的促進(jìn)作用。關(guān)于補陽還五湯的抗氧化作用已有初步研究,但對雪旺細(xì)胞氧化損傷保護(hù)作用的機理尚未見報道。 本課題通過建立過氧化氫誘導(dǎo)雪旺細(xì)胞氧化損傷的模型,并在此模型的基礎(chǔ)上,觀察補陽還五湯對氧化損傷的雪旺細(xì)胞的保護(hù)作用。通過MTT、生化檢測、免疫組化、RT-PCR測定、激光掃描共聚焦顯微鏡

4、進(jìn)行熒光定量分析等方法進(jìn)行細(xì)胞活力測定、酶活力分析、細(xì)胞內(nèi)蛋白含量、GDNFmRNA表達(dá)水平及鈣離子濃度定量測定等,探討補陽還五湯抗氧化損傷的作用機理,為更好的指導(dǎo)臨床用藥提供理論依據(jù)。 方法:本課題從Wistar新生大鼠的坐骨神經(jīng)和正中神經(jīng)取材,進(jìn)行體外培養(yǎng)雪旺細(xì)胞。培養(yǎng)48小時后,分為3個實驗組,另設(shè)一空白對照組。 1.補陽還五湯提取液的制備:補陽還五湯由黃芩60克,當(dāng)歸、川芎、桃仁、紅花、地龍、赤勺各10克組成,用

5、水煎醇沉法(75%乙醇)提取,生藥含量為2g/ml,4℃保存,在使用時過濾除菌。 2.雪旺細(xì)胞的純化及鑒定:加入阿糖胞苷以去除成纖維細(xì)胞,在培養(yǎng)3d時做S-100蛋白免疫組化染色,鑒定雪旺細(xì)胞。 3.氧化損傷及藥物處理:細(xì)胞培養(yǎng)時分三組:過氧化氫損傷組:H2O2終濃度為0.5%;補陽還五湯保護(hù)組:0.5%H2O2+600μg/ml補陽還五湯提取液;正常組(不加任何因素);同時設(shè)僅加培養(yǎng)液的空白對照組。 4.MTT

6、法進(jìn)行補陽還五湯抗過氧化氫氧化損傷的作用分析。 5.生化檢測法進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化物MDA和超氧化物歧化酶SOD水平的檢測。 6.應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法,對過氧化氫損傷組、補陽還五湯保護(hù)組及正常對照組三組細(xì)胞進(jìn)行Caspase-3蛋白酶變化的測定。 7.Fluo-3/Am對細(xì)胞進(jìn)行熒光染色后,應(yīng)用激光掃描共聚焦顯微鏡對不同實驗組細(xì)胞內(nèi)鈣離子的濃度變化進(jìn)行圖像采集及定量分析。 8.正常對照組、過氧化氫損傷組及

7、補陽還五湯保護(hù)組用RT-PCR法檢測GDNFmRNA的表達(dá)變化情況。 通過以上的實驗,建立過氧化氫誘導(dǎo)雪旺細(xì)胞的氧化損傷模型,在此模型的基礎(chǔ)上探討補陽還五湯對雪旺細(xì)胞抗氧化保護(hù)作用的機理。 結(jié)果:剛接種的原代雪旺細(xì)胞呈圓形,懸浮在培養(yǎng)液中,次日觀察可見絕大多數(shù)細(xì)胞已經(jīng)貼壁,胞體較小,呈梭形,飽滿立體感強,有兩個細(xì)長的突起,在培養(yǎng)24小時后加終濃度為10-5mol/L的阿糖胞苷,48小時后換液去除阿糖胞苷后,鏡下觀察免疫化

8、學(xué)染色顯示80%以上的細(xì)胞S-100呈陽性反應(yīng)。加入H2O212小時后,在倒置顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生改變,細(xì)胞突起萎縮,胞體腫脹變圓,細(xì)胞數(shù)量減少,部分細(xì)胞脫壁漂浮于培養(yǎng)液中,胞體立體感差,折光度下降,并可見大量細(xì)胞碎片;補陽還五湯保護(hù)組細(xì)胞生長狀態(tài)良好,胞體飽滿立體感強,少見細(xì)胞皺縮破碎現(xiàn)象,但細(xì)胞聚團現(xiàn)象較明顯;正常組細(xì)胞狀態(tài)長勢很好。 不同實驗組檢測結(jié)果如下: 1.MTT法進(jìn)行補陽還五湯抗氧化損傷的作用分析

9、表明:補陽還五湯可明顯拮抗過氧化氫誘導(dǎo)的氧化損傷,與過氧化氫損傷組相比,補陽還五湯保護(hù)組可維持較高的細(xì)胞存活率,二者之間有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);補陽還五湯保護(hù)組細(xì)胞存活率雖然低于正常組,但無統(tǒng)計學(xué)意義。 2.生化檢測表明:與損傷組相比,補陽還五湯保護(hù)組能使細(xì)胞內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)維持于較高的活力水平,表明補陽還五湯可明顯拮抗過氧化氫引起的SOD降低;同時低于正常對照組,有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。 3.生化

10、檢測表明:與正常組相比,過氧化氫引起細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化物的大量堆積,而補陽還五湯可明顯降低細(xì)胞中過氧化物的含量(P<0.05)。 4.免疫組織化學(xué)法檢測Caspase-3蛋白酶:過氧化氫損傷組Caspase-3呈強陽性,而補陽還五湯保護(hù)組Caspase-3呈弱陽性,正常組幾乎無著色。 5.激光掃描共聚焦顯微鏡分析細(xì)胞中鈣離子濃度變化:過氧化氫損傷組細(xì)胞中鈣離子濃度顯著升高,熒光強度明顯較強;而補陽還五湯保護(hù)組和正常組細(xì)胞中

11、鈣離子著色的熒光強度較接近且明顯較弱。 6.RT-PCR檢測GDNFmRNA表達(dá)情況:過氧化氫損傷組細(xì)胞中GDNFmRNA表達(dá)量很少,而補陽還五湯保護(hù)組GDNFmRNA表達(dá)量要高于損傷組(P<0.05),正常組的表達(dá)量最高。 結(jié)論:我們以原代培養(yǎng)的雪旺細(xì)胞為實驗材料,在過氧化氫誘導(dǎo)雪旺細(xì)胞的氧化損傷模型的基礎(chǔ)上,觀察過氧化氫誘導(dǎo)雪旺細(xì)胞的氧化損傷及補陽還五湯對氧化損傷的雪旺細(xì)胞的保護(hù)作用。實驗結(jié)果顯示:過氧化氫損傷能夠引

12、起細(xì)胞內(nèi)自由基增多,SOD活力降低,脂質(zhì)過氧化物增多,并且自由基的增多能通過信號通路上Caspase-3最終引起細(xì)胞的凋亡;補陽還五湯則能夠降低細(xì)胞內(nèi)MDA脂質(zhì)氧化物含量,維持超氧化物歧化酶含量,還能通過降低鈣離子濃度及凋亡蛋白酶Caspase-3來影響死亡事件的發(fā)生,證明補陽還五湯可以明顯拮抗過氧化氫對雪旺細(xì)胞的氧化損傷。 本研究是補陽還五湯對雪旺細(xì)胞氧化損傷保護(hù)作用機理的實驗研究,從氧化損傷信號傳導(dǎo)通路方面來探討補陽還五湯的

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