氯沙坦改善5-6腎切除大鼠生存率及修復(fù)足細(xì)胞損傷的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景和目的：
　　 越來(lái)越多的流行病學(xué)調(diào)查表明，慢性腎臟病(chronic kidney disease，CKD)是威脅全球公共健康的主要疾病之一。本課題組前期研究結(jié)果顯示，鄭州市20歲以上成年人CKD標(biāo)化患病率為11.51％。從病理進(jìn)展的角度來(lái)講，無(wú)論其病因?yàn)楦哐獕骸⑻悄虿』蛘呗阅I炎，CKD進(jìn)展至終末期腎臟病時(shí)，病理類(lèi)型主要表現(xiàn)為腎小球硬化和腎小管間質(zhì)纖維化。目前很多研究關(guān)于人類(lèi)腎臟疾病或者動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，腎素-血管緊張素系

2、統(tǒng)（Renin-angiotensin system，RAS）在腎臟疾病的發(fā)生發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用。腎素-血管緊張素系統(tǒng)的過(guò)度興奮不僅僅表現(xiàn)為通過(guò)血液動(dòng)力學(xué)的改變促使血壓上升，加速殘腎單位的腎小球硬化，而且血管緊張素Ⅱ（Angiotensin Ⅱ，Ang Ⅱ）還通過(guò)一些非血液動(dòng)力學(xué)的作用直接或間接地參與了腎小球硬化的發(fā)生與發(fā)展。RAS抑制劑——血管緊張素受體拮抗劑(Angiotensin receptor antagonist，AR

3、B)的臨床應(yīng)用成為抑制腎小球硬化、延緩CKD進(jìn)展的有效方法之一。本課題組Fogo等前期進(jìn)行的動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究提出大劑量RAS抑制劑可通過(guò)降低纖溶酶原激活物抑制物-1(Plasminogen activator inhibitor-1，PAI-1）的表達(dá)從而逆轉(zhuǎn)腎小球硬化。而PAI-1除了具有抑制細(xì)胞外基質(zhì)分解促進(jìn)合成的作用，同時(shí)PAI-1也在足細(xì)胞中表達(dá)，可以直接調(diào)節(jié)足細(xì)胞分化和細(xì)胞骨架重構(gòu)。足細(xì)胞是腎小球?yàn)V過(guò)屏障的重要組成部分，足細(xì)胞

4、損傷必將導(dǎo)致蛋白尿的出現(xiàn)并促進(jìn)腎小球硬化。腎小球硬化與細(xì)胞外基質(zhì)的增多積聚密不可分，Ⅳ型膠原作為細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜的主要成分，其合成和分泌增多是導(dǎo)致腎小球硬化的主要參與因素之一。目前足細(xì)胞損傷及修復(fù)是腎臟病學(xué)研究的熱點(diǎn)，最新研究顯示壁層上皮細(xì)胞具有轉(zhuǎn)分化為足細(xì)胞的潛能，進(jìn)而修復(fù)損傷的足細(xì)胞。然而，長(zhǎng)期應(yīng)用ARB是否可以更多地保護(hù)足細(xì)胞、逆轉(zhuǎn)腎小球硬化、改善長(zhǎng)期生存率，目前尚缺乏與此相關(guān)的報(bào)道。因此，本研究擬采用5/6腎切除大鼠模型，觀察

5、長(zhǎng)期應(yīng)用ARB（氯沙坦）對(duì)CKD大鼠生存率的改善及其對(duì)足細(xì)胞的保護(hù)作用，并通過(guò)體外原代培養(yǎng)足細(xì)胞，觀察血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)足細(xì)胞凋亡情況和氯沙坦對(duì)受損足細(xì)胞分泌Ⅳ型膠原的影響，深入探討了ARB對(duì)足細(xì)胞損傷保護(hù)作用及可能機(jī)制，為臨床長(zhǎng)期應(yīng)用ARB延緩CKD進(jìn)展、改善CKD生存率提供可能的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 本研究共分兩個(gè)部分:
　　 體內(nèi)實(shí)驗(yàn):觀察長(zhǎng)期應(yīng)用氯沙坦改善5/6腎切除CKD大鼠生存率及其對(duì)足細(xì)胞損傷的修復(fù)作用
　

6、　 建立5/6腎切除CKD大鼠模型并于8周末通過(guò)開(kāi)放腎活檢證實(shí)腎小球硬化，觀察長(zhǎng)期應(yīng)用氯沙坦對(duì)大鼠30周生存率的改善作用和腎組織PAI-1的表達(dá)，并探討氯沙坦對(duì)足細(xì)胞的保護(hù)作用及其機(jī)制。
　　 體外實(shí)驗(yàn):探討氯沙坦對(duì)血管緊張素Ⅱ刺激足細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制
　　 體外原代培養(yǎng)WT和PAI-1-/-小鼠足細(xì)胞，分別給予血管緊張素Ⅱ刺激，觀察足細(xì)胞凋亡情況，進(jìn)一步證實(shí)血管緊張素Ⅱ促進(jìn)PAI-1分泌誘導(dǎo)足細(xì)胞凋亡;在此基

7、礎(chǔ)上給予氯沙坦干預(yù)，觀察血管緊張素Ⅱ?qū)ψ慵?xì)胞分泌Ⅳ型膠原的情況及氯沙坦對(duì)受損足細(xì)胞分泌Ⅳ型膠原的影響，深入探討了氯沙坦對(duì)足細(xì)胞的保護(hù)作用及機(jī)制。
　　 第一部分:體內(nèi)實(shí)驗(yàn)長(zhǎng)期應(yīng)用氯沙坦改善5/6腎切除CKD大鼠生存率及對(duì)足細(xì)胞損傷的修復(fù)作用
　　 一、材料與方法：
　　 雄性SD大鼠50只，250～300克。建立5/6腎切除CKD大鼠模型并于8周末通過(guò)開(kāi)放腎活檢PAS染色證實(shí)腎小球硬化，經(jīng)歷兩次手術(shù)后存活大鼠41

8、只，按照腎小球硬化指數(shù)(SclerosisIndex，SI)、血壓、24小時(shí)尿蛋白定量匹配后分為兩組:對(duì)照組(CONT,n=21)，ARB組(ARB，氯沙坦200mg/L溶于飲用水中，n=20)，兩組SI、血壓、24小時(shí)尿蛋白定量平均值相當(dāng)。于0、8、16、24及30周分別測(cè)量體重、血壓、24小時(shí)尿蛋白定量和血肌酐;觀察大鼠存活情況至30周，于瀕死前或30周末處死大鼠留取腎組織，行PAS染色觀察腎小球硬化程度的變化，行Westernbl

9、ot觀察腎組織PAI-1的表達(dá)，行免疫組織化學(xué)方法WT-1染色（足細(xì)胞標(biāo)記）和免疫熒光雙染法Claudin1（壁層上皮細(xì)胞標(biāo)記）和Synaptopodin（足細(xì)胞標(biāo)記）染色檢測(cè)腎小球內(nèi)足細(xì)胞損害/修復(fù)及壁層上皮細(xì)胞-足細(xì)胞轉(zhuǎn)化。用Kaplan-Meier法進(jìn)行單因素生存分析（用log-rank法進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)），并繪制生存曲線(xiàn)。將單因素分析對(duì)生存率有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的因素再納入多因素Cox回歸分析模型進(jìn)行分析，運(yùn)用ROC曲線(xiàn)評(píng)價(jià)硬化指數(shù)在生存

10、評(píng)判中的價(jià)值，并找出適宜的臨界點(diǎn)值。所得結(jié)果選取α=0.05作為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的檢驗(yàn)水準(zhǔn)。
　　 二、結(jié)果：
　　 1.兩組大鼠8周時(shí)血壓、24小時(shí)尿蛋白定量均升高，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，16、24周時(shí)ARB組血壓、24小時(shí)尿蛋白定量均低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。24、30周ARB組血肌酐均低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 2.ARB組大鼠30周生存率明顯高于

11、對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（中位生存時(shí)間27.1周vs19.7周，ARBvsCONT，P=0.0056）。單因素生存分析結(jié)果顯示腎活檢時(shí)硬化指數(shù)(P=0.0057)、蛋白尿(P=0.0113)、是否給予ARB干預(yù)(P=0.0128)是影響生存率的重要因素。根據(jù)多因素Cox回歸分析模型得到，在其他因子水平固定的情況下，對(duì)照組的死亡風(fēng)險(xiǎn)是ARB組的3.5倍（P=0.0019），腎活檢即給予干預(yù)時(shí)硬化指數(shù)每增加一個(gè)單位，死亡風(fēng)險(xiǎn)增加2.9倍(P

12、=O.0006)。腎活檢硬化指數(shù)的ROC曲線(xiàn)下面積(AUC)為0.65，最佳Cut-off值取1.1，即對(duì)于慢性腎臟病大鼠，應(yīng)于早期進(jìn)行干預(yù)以延長(zhǎng)生存時(shí)間。根據(jù)Cut-off值對(duì)大鼠分成亞組，ARB對(duì)硬化指數(shù)不同的大鼠生存率均有改善（SI＜1.1大鼠，中位生存時(shí)問(wèn)＞30周vs20.6周，ARBvsCONT，P=0.0284;SI＞1.1大鼠，中位生存時(shí)間22周vs17.3周，ARBvsCONT，P=0.0153)。
　　 3.A

13、RB組大鼠終點(diǎn)時(shí)間點(diǎn)平均硬化指數(shù)和每周硬化指數(shù)進(jìn)展率均低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 4.ARB組大鼠終點(diǎn)時(shí)間點(diǎn)PAI-1表達(dá)低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 5.腎活檢時(shí)各組腎小球內(nèi)足細(xì)胞較正常大鼠減少，壁層上皮細(xì)胞數(shù)目較正常大鼠明顯增多，終點(diǎn)時(shí)間時(shí)ARB組腎小球內(nèi)足細(xì)胞數(shù)目及壁層上皮細(xì)胞的表達(dá)均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);免疫熒光雙染顯示ARB組存在更多壁層

14、上皮細(xì)胞標(biāo)記Claudin-1和足細(xì)胞標(biāo)記Synaptopodin雙陽(yáng)性情況，提示ARB可能促進(jìn)壁層上皮細(xì)胞-足細(xì)胞轉(zhuǎn)分化修復(fù)足細(xì)胞損傷。
　　 第二部分:體外實(shí)驗(yàn)氯沙坦對(duì)血管緊張素Ⅱ刺激足細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及機(jī)制探討
　　 一、材料與方法：
　　 原代培養(yǎng)野生型和PAI-1-/-小鼠足細(xì)胞，行WT-1、nephrin和Synaptopodin染色鑒定。將野生型和PAI-1-/-小鼠足細(xì)胞分別分為兩組:對(duì)照組、A

15、ngⅡ(10-7M，24h)，檢測(cè)細(xì)胞上清中PAI-1的活性及PAI-1缺失對(duì)AngⅡ所致足細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用。為觀察ARB對(duì)AngⅡ刺激足細(xì)胞分泌Ⅳ型膠原的影響及PAI-1在其中發(fā)揮的作用，我們將野生型和PAI-1-/-小鼠足細(xì)胞分別分為三組:對(duì)照組、AngⅡ(10-7M，48h)組和AngⅡ(10-7M，48h)+ARB(10-5M，72h)組，ELISA法檢測(cè)細(xì)胞上清中IV型膠原表達(dá)量。
　　 二、結(jié)果：
　　 1

16、.足細(xì)胞的鑒定。免疫熒光染色鑒定3個(gè)表達(dá)分化成熟的足細(xì)胞標(biāo)志性抗原WT-1、nephrin和synaptopodin，證實(shí)該細(xì)胞為純化的足細(xì)胞。
　　 2.AngⅡ刺激野生型小鼠足細(xì)胞分泌PAI-1增多，AngⅡ使野生型足細(xì)胞凋亡增加90.91％，給予AngⅡ刺激后，野生型小鼠足細(xì)胞抑制凋亡蛋白Bcl-xL表達(dá)較對(duì)照組顯著下降（P＜0.05）;而AngⅡ?qū)Al-1-/-小鼠足細(xì)胞的刺激分泌PAI-1和凋亡影響不大，對(duì)Bcl-x

17、L表達(dá)量也并無(wú)影響（P＞0.05）。
　　 3.ELISA結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，AngⅡ可明顯誘導(dǎo)野生型小鼠足細(xì)胞Ⅳ型膠原分泌增多(P＜0.05)，給予ARB后可幾乎完全阻斷AngⅡ的這種誘導(dǎo)作用;而與野生型足細(xì)胞相比，PAI-1缺失可減少AngⅡ誘導(dǎo)足細(xì)胞Ⅳ型膠原的分泌(P＜0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1.氯沙坦可改善5/6腎切除大鼠30周生存率，腎小球硬化程度較低的大鼠生存時(shí)間較長(zhǎng)。
　　 2

18、.氯沙坦可降低5/6腎切除大鼠血壓、蛋白尿，改善腎功能，延緩腎小球硬化進(jìn)展。
　　 3.氯沙坦對(duì)腎臟的保護(hù)作用可能是通過(guò)降低PAI-1表達(dá)介導(dǎo)的。
　　 4.壁層上皮細(xì)胞-足細(xì)胞轉(zhuǎn)分化可能參與了損傷足細(xì)胞的修復(fù)，氯沙坦可能促進(jìn)該轉(zhuǎn)分化過(guò)程延緩CKD進(jìn)展。
　　 5.PAI-1缺失可改善血管緊張素Ⅱ所致足細(xì)胞凋亡。
　　 6.氯沙坦可阻斷血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)足細(xì)胞的Ⅳ型膠原分泌，PAI-1缺失可減少AngⅡ誘導(dǎo)