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文檔簡介
1、研究背景及目的:
裸鼴鼠是一種終年生活在地下、營真社會性生活的嚙齒類動物,多分布于非洲肯尼亞、埃塞俄比亞等地區(qū)。1967年,裸鼴鼠被國外學者引進實驗室,半個世紀以來,國內外學者對其展開了一系列的研究,研究報道相繼發(fā)表于Nature、Science等期刊。在已有的報道中,國內外學者針對裸鼴鼠開展的研究多集中于其壽命長、耐受低氧、缺少疼痛物質、自發(fā)性腫瘤鮮有等方面,但是對其免疫系統(tǒng)的研究報道甚少。免疫系統(tǒng)是生物醫(yī)學研究的重要指標,
2、不僅對動物生理狀態(tài)的判斷和飼養(yǎng)管理具有指導意義,也是臨床醫(yī)療和科學研究的重要依據(jù)。目前已有研究報告揭示免疫系統(tǒng)與癌癥之間的關系:隨著機體的衰老,其免疫系統(tǒng)也逐漸惡化,這個過程即為免疫衰老,而免疫衰老與全身性炎癥、慢性炎癥性疾病以及許多癌癥相關。因此,本研究率先針對裸鼴鼠的免疫系統(tǒng)進行初步研究,從免疫學的角度來闡釋裸鼴鼠壽命長、腫瘤發(fā)生率低等生物學特性的機制,進而為人類老年疾病、炎癥性疾病及腫瘤的發(fā)病機制提供理論依據(jù),同時也為老年疾病、炎
3、癥性疾病及腫瘤等疾病的治療提供新的思路和想法。
研究方法:
本研究分別選取機體最大的免疫器官脾臟和機體重要的免疫細胞巨噬細胞進行裸鼴鼠免疫系統(tǒng)的初步研究。
首先,分離裸鼴鼠和小鼠脾臟淋巴細胞,采用流式細胞術比較裸鼴鼠和小鼠脾臟中免疫細胞的比例。
其次,建立裸鼴鼠骨髓來源巨噬細胞分離培養(yǎng)的方法,采用流式細胞術比較裸鼴鼠和小鼠骨髓來源巨噬細胞的吞噬功能。
再次,polyI∶C模擬病毒感染骨髓
4、來源巨噬細胞,采用流式細胞術比較刺激前后裸鼴鼠和小鼠骨髓來源巨噬細胞的凋亡情況,采用熒光定量PCR技術比較刺激前后裸鼴鼠和小鼠骨髓來源巨噬細胞TLR3和IFN-β表達量的變化情況,進一步采用蛋白免疫印跡技術比較刺激前后裸鼴鼠和小鼠骨髓來源巨噬細胞TLR3和NF-κB表達量的變化情況,研究裸鼴鼠巨噬細胞在抵抗病毒入侵中可能存在的機制。
最后,LPS模擬革蘭氏陰性細菌感染骨髓來源巨噬細胞,采用流式細胞術比較刺激前后裸鼴鼠和小鼠骨髓
5、來源巨噬細胞的凋亡情況,采用熒光定量PCR技術比較刺激前后裸鼴鼠和小鼠骨髓來源巨噬細胞TLR4和TNF-α表達量的變化情況,進一步采用蛋白免疫印跡技術比較刺激前后裸鼴鼠和小鼠骨髓來源巨噬細胞TLR4和NF-κB表達量的變化情況,研究裸鼴鼠巨噬細胞在抵抗細菌感染中可能存在的機制。
結果:
脾臟淋巴細胞中免疫細胞比例比較
分離裸鼴鼠和小鼠脾臟淋巴細胞,采用流式細胞術檢測各類免疫細胞的比例,結果如下:小鼠脾臟巨噬
6、細胞的比例為15.54±2.12%,B細胞的比例為43.21±9.34%,T細胞的比例為37.54±4.50%,NK細胞的比例為6.06±0.23%;裸鼴鼠脾臟巨噬細胞的比例為34.96±5.85%,B細胞的比例為2.34±0.67%,T細胞的比例為32.14±4.66%,NK細胞的比例為3.09±0.16%。和小鼠相比較,裸鼴鼠脾臟淋巴細胞中巨噬細胞的比例較高,而B細胞的比例較低,T細胞和NK細胞的比例基本無差異。
建立骨髓
7、來源巨噬細胞分離培養(yǎng)的方法及吞噬功能比較
參照經(jīng)典的小鼠骨髓來源巨噬細胞分離培養(yǎng)的方法,首先分離裸鼴鼠骨髓干細胞,然后利用粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子誘導造血干細胞轉化為巨噬細胞,并采用流式細胞術進行純度的鑒定,檢測細胞表面蛋白CD11b比例高達90%,鑒定分離培養(yǎng)的細胞為骨髓來源巨噬細胞。分別采用吞噬紅細胞法和流式細胞術檢測裸鼴鼠和小鼠骨髓來源巨噬細胞的吞噬率,裸鼴鼠骨髓來源巨噬細胞的吞噬率為99.81±0.13%,小鼠骨髓
8、來源巨噬細胞的吞噬率為88.79±0.90%,結果表明裸鼴鼠巨噬細胞的吞噬功能強于小鼠巨噬細胞。
polyI∶C刺激巨噬細胞前后的比較
相同濃度的polyI∶C模擬病毒感染裸鼴鼠和小鼠骨髓來源巨噬細胞,一定時間后檢測細胞的凋亡,分別提取RNA和蛋白質,檢測Toll樣受體3、干擾素β、NF-κB的表達量。結果表明,polyI∶C刺激前后裸鼴鼠和小鼠骨髓來源巨噬細胞凋亡均有所升高;且細胞中TLR3、IFN-β、NF-κB
9、的表達量均升高。相較于小鼠,裸鼴鼠骨髓來源巨噬細胞凋亡升高不顯著,細胞中TLR3表達量升高不明顯,但是IFN-β的表達卻顯著升高。
LPS刺激巨噬細胞前后的比較
相同濃度的LPS模擬細菌感染裸鼴鼠和小鼠骨髓來源巨噬細胞,一定時間后檢測細胞的凋亡,分別提取RNA和蛋白質,檢測Toll樣受體4、腫瘤壞死因子α、核轉錄因子κB的表達量。結果表明,LPS刺激前后裸鼴鼠骨髓來源巨噬細胞凋亡未有升高,而小鼠骨髓來源巨噬細胞凋亡率
10、升高。細胞中TLR4、TNF-α、NF-κB的表達量均升高,相較于小鼠,裸鼴鼠骨髓來源TLR4蛋白表達量升高不顯著,而細胞中NF-κB蛋白的表達量升高差異明顯,且TNF-α的表達也顯著升高。
結論:
采用流式細胞術證實裸鼴鼠脾臟中巨噬細胞的比例較高,繼而進行裸鼴鼠和小鼠巨噬細胞功能的比較。流式細胞術檢測結果表明裸鼴鼠巨噬細胞的吞噬功能強于小鼠巨噬細胞。采用熒光定量PCR和蛋白免疫印跡實驗技術研究巨噬細胞產(chǎn)生免疫應答時
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