TAT-rhaFGF融合蛋白對大鼠壓瘡潰瘍的治療作用研究.pdf

1、目的:
　　皮膚深部組織損傷是臨床護(hù)理過程中出現(xiàn)的嚴(yán)重醫(yī)療事故，現(xiàn)今還未有有效的治療方法。研究顯示，aFGF(Acidic fibroblast growth factor)可以顯著改善糖尿病引起的潰瘍;但是由于皮膚屏障的存在，aFGF無法對深部組織損傷發(fā)揮治療作用。本項課題的目的是利用表皮完整的大鼠壓瘡作為模型，研究TAT（Transactivator of transcription protein of HIV）介導(dǎo)aFGF

2、在皮膚屏障的穿膜效應(yīng)，并考察TAT-rhaFGF融合蛋白對大鼠壓瘡的治療效果。同時結(jié)合細(xì)胞實驗深入探討TAT-rhaFGF融合蛋白發(fā)揮作用的分子機(jī)制。
　　方法:
　　1.TAT-rhaFGF融合蛋白的表達(dá)、純化以及鑒定
　　通過分子生物學(xué)構(gòu)建質(zhì)粒載體，將測序鑒定正確的TAT-rhaFGF融合蛋白重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌BL21(DE3)，利用100 ug/mL氨芐西林抗性瓊脂板篩選出陽性轉(zhuǎn)化子。用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)

3、重組蛋白，得出最佳的表達(dá)條件，同時確定蛋白表達(dá)形式。利用肝素親和層析和離子交換樹脂聯(lián)用，分離純化TAT-rhaFGF蛋白，將所得到的重組蛋白進(jìn)行western bloting鑒定。最后用SDS-PAGE和高效液相色譜鑒定蛋白純度，分裝凍存?zhèn)溆??！?br>　　2.TAT-rhaFGF蛋白—凝膠的制備
　　為解決給藥劑量不準(zhǔn)確，蛋白在常溫容易失活的缺陷，本試驗中將融合蛋白制備成一種溫敏凝膠制劑。
　　3.TAT-rhaFGF蛋白

4、在健康小鼠背部皮膚的穿膜考察
　　將48只Balb/c小鼠麻醉，剔去小鼠背部毛發(fā)(3 cm×3 cm)。24 h小時之后將50μl（60μg/ml）aFGF、TAT-rhaFGF、PBS溶液均勻涂抹于小鼠背部皮膚。在不同時間點(0 min，30 min，2h，8h)處死小鼠，并獲取小鼠皮膚及皮下肌肉組織，4％多聚甲醛固定。常規(guī)石蠟包埋、切片，免疫組織化學(xué)檢測真皮層內(nèi)以及皮下組織aFGF的含量。
　　4.TAT-rhaFGF改

5、善大鼠壓瘡潰瘍研究
　　分別在造模后0天、3天、7天、14天紀(jì)錄表觀形態(tài)學(xué)變化。取造模處皮膚及皮下肌肉組織，4％多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋、切片。利用HE、Masson、Tunel、免疫組織化學(xué)染色等病理學(xué)手段，結(jié)合病理學(xué)跟分子生物學(xué)探討損傷部位的修復(fù)情況。最后向通過向人皮膚成纖維細(xì)胞中加入TNF-α模擬炎癥狀態(tài)，考察人成纖維細(xì)胞中α-SMA，TGF-β1 and TGFβRⅡ表達(dá);接著用TAT-rhaFGF進(jìn)行干預(yù)，利用west

6、ern blot技術(shù)進(jìn)一步探索TAT-rhaFGF發(fā)揮作用的分子機(jī)制。
　　結(jié)果:
　　1.重組蛋白的表達(dá)純化、western blot鑒定
　　經(jīng)肝素親和色譜與離子交換色譜純化后，SDS-PAGE電泳顯示TAT-rhaFGF純度達(dá)90％以上。通過Western blot鑒定，所純化到的蛋白為TAT-rhaFGF融合蛋白。
　　2.通過處方優(yōu)化，制備得到穩(wěn)定且具有活性的TAT-rhaFGF溫敏性凝膠
　　成

7、功制備得到穩(wěn)定的TAT-rhaFGF凝膠。格魯斯特新藥部活性結(jié)果為:該TAT-rhaFGF凝膠在4℃的穩(wěn)定性明顯高于溶液狀態(tài)下的TAT-rhaFGF。在4℃和25℃存放三個月后，凝膠中的TAT-rhaFGF仍然具有活性。
　　3.TAT介導(dǎo)rhaFGF穿透小鼠背部皮膚及大鼠皮膚
　　結(jié)果發(fā)現(xiàn)，小鼠背部給予TAT-rhaFGF之后2小時，即可用免疫組化的方法在真皮層檢測到陽性aFGF信號。在大鼠皮膚中，給藥后5h用免疫熒光的手

8、段同樣檢測到了陽性信號;而aFGF組跟PBS組則均為陰性。
　　4.TAT-rhaFGF融合蛋白可以顯著改善損傷組織修復(fù)
　　較aFGF凝膠與空白凝膠對照組，TAT-rhaFGF融合蛋白給藥后可以明顯加速創(chuàng)傷的修復(fù)。TUNEL結(jié)果顯示TAT-rhaFGF融合蛋白給藥后凋亡指數(shù)顯著降低。HE與Masson染色結(jié)果表明TAT-rhaFGF融合蛋白可以加速創(chuàng)傷的生理性修復(fù)。免疫組化結(jié)果表明TAT-rhaFGF融合蛋白的可以在創(chuàng)傷修

9、復(fù)前期促進(jìn)皮膚肌肉組織細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)合成，從而加速創(chuàng)傷的修復(fù);在后期則可以下調(diào)皮膚中TGF-β1與α-SMA的表達(dá)，抑制瘢痕的形成，從而促進(jìn)皮膚組織的生理性修復(fù)。
　　結(jié)論:
　　1.成功表達(dá)純化TAT-rhaFGF融合蛋白。
　　2.經(jīng)過處方優(yōu)化，所制備的凝膠可以顯著改善TAT-rhaFGF融合蛋白在4度時的穩(wěn)定性，且不影響蛋白的活性。
　　3.通過免疫組化考察不同時間點時皮膚組織中aFGF的含量，結(jié)