角膜滴用TAT-aFGF-His蛋白對大鼠視網膜缺血再灌注損傷的治療.pdf

1、目的： 1.第一部分 觀察由HIV-1的反式激活蛋白轉導域(TAT-proteintransductiondomain，TAT-PTD)攜帶的人酸性成纖維細胞生長因子(humanacidicFibroblastGrowthFactor，aFGF)和6×組氨酸的融合蛋白TAT-aFGF-His通過角膜滴入給藥進入視網膜組織的情況。并構建融合蛋白aFGF-His作為對照蛋白。 2.第二部分 眼角膜滴用融合蛋白

2、TAT-aFGF-His對大鼠實驗性視網膜缺血再灌注(retinalischemia-reperfusion，RIR)損傷的治療作用，并探討其作用機理。 方法： 1.第一部分 PCR擴增aFGF-His基因片段，利用BglⅡ和BamHⅠ的同尾酶特性，用NdeⅠ和BglⅡ雙酶切擴增產物并與NdeⅠ和BamHⅠ雙酶切處理的質粒pET-3c相連，轉化至大腸桿菌DH5α，氨卞青霉素篩選陽性克隆。抽提經測序鑒定序列正確的重

3、組質粒，轉化至大腸桿菌BL21(DE3)，利用氨卞抗性篩選出轉化子。分別用IPTG誘導表達融合蛋白TAT-aFGF-His和aFGF-His，cM離子交換及肝素親和兩步層析法分離純化蛋白。 健康SD大鼠36只隨機分為生理鹽水組(NS組)、aFGF-His組和TAT-aFGF-His組，每組12只，NS組滴入生理鹽水，aFGF-His組滴入2μgaFGF-His，TAT-aFGF-His組滴入2μgTAT-aFGF-His。大鼠給

4、藥后分別于10min、30min、1h、2h、4h和8h處死，每時間點2只，雙眼給藥。用6×His抗體，采用免疫組化SABC法檢測aFGF-His和TAT-aFGF-His在角膜和視網膜組織的分布情況。 2.第二部分 健康SD大鼠45只隨機分為生理鹽水治療組(簡稱A組)、aFGF-His治療組(簡稱B組)、TAT-aFGF-His治療組(簡稱C組)。各組大鼠均采用前房灌注加壓形成14.6kPa高眼壓，維持60min建立R

5、IR模型。再灌注開始后及每隔1d，A組滴入生理鹽水，B組滴入2μgaFGF-His，C組滴入2μgTAT-aFGF-His進行治療。各組大鼠分別于再灌注1，3，7d處死，每時間點5只，每組右眼為實驗眼，左眼為正常對照眼。動物造模前及處死前行視網膜點圖(ERG)檢測，記錄ERGa波和b波波幅。光學顯微鏡下觀察視網膜組織病理學變化(HE染色)，記錄視網膜內層(IRL)厚度和視網膜神經節(jié)細胞(RGCs)數目的變化。采用原位凋亡檢測法(TUNE

6、L)檢測視網膜神經節(jié)細胞層(GCL)和內核層(INL)的細胞凋亡情況。 結果： 1.第一部分 正確構建表達質粒載體pET-aFGF-His。經IPTG誘導后，融合蛋白TAT-aFGF-His和aFGF-His的表達量分別占菌體總蛋白的30％和27％，均為可溶性表達。經兩步層析純化后，獲得了純度大于95％的TAT-aFGF-His和aFGF-His蛋白。免疫組化結果表明，NS組、aFGF-His組在角膜和視網膜組織

7、均未見到His染色陽性細胞。TAT-aFGF-His組在10min、30min、1h、2h、4h、8h的角膜和視網膜組織均能見到陽性細胞，主要分布在角膜上皮細胞層和視網膜節(jié)細胞層。10min時有微量TAM-aFGF-His進入視網膜組織，30min時TAT-aFGF-His在視網膜的分布達到高峰，8h時TAT-aFGF-His大部分被清除。 2.第二部分 ①ERG檢查：與A組相比，B組ERGa波和b波波幅在1，3，7d均

8、無明顯差異(P＞0.05)。與A和B組比較，再灌注3d，C組ERGa波波幅(149.6±26.33μv)明顯高于A組(25.6±7.40μv)和B組(49.8±5.89μv)(P＜0.01和P＜0.05)；再灌注3，7d，C組ERGb波波幅(194.8±38.92μv和334.0±67.52μv)明顯高于A組(62.0±15.41μv和145.2±22.51μv)和B組(60.8±8.07μv和152.8±22.16μv)(P＜0.05

9、)。 ②視網膜組織病理學變化：RIR損傷早期，IRL水腫增厚，GCL和INL均可見核固縮細胞，晚期RGCs數目減少，IRL萎縮變薄。與A組相比，B組在再灌注1d，IRL厚度有差異(P＜0.05)，而其余各時間點，RGCs數目和IRL厚度均無差異(P＞0.05)。與A和B組比較，再灌注1d，C組IRL水腫更嚴重(P＜0.05)，而RGCs數目均多于前兩組，但只與A組有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)；再灌注3d，C組與前兩組相比，IRL

10、厚度均無差異(P＞0.05)，而RGCs數目明顯多于前兩組(P＜0.01)；再灌注7d，C組IRL厚度大于前兩組(P＜0.05)，且RGCs數目均多于前兩組(P＜0.01)。 ③視網膜組織細胞凋亡：正常大鼠視網膜TUNEL染色陰性，A、B、C組視網膜GCL和INL均可見大量棕黃色陽性細胞，并隨再灌注時間的增加而減少。與A組相比，B組在再灌注各時間點的陽性細胞數均無顯著差異(P＞0.05)。與A和B組比較，再灌注1d，C組INI，

11、的陽性細胞與A組有差異(P＜0.05)，但與B組無顯著差異(P＞0.05)；再灌注3d，C組GCL和INL的陽性細胞數明顯少于前兩組(P＜0.01)；再灌注7d，C組GCL的陽性細胞明顯少于前兩組(P＜0.05)。 結論： 1.角膜滴用2μgaFGF-His蛋白不能進入視網膜組織，TAT蛋白轉導域能有效攜帶aFGF-His(TAT-aFGF-His)穿透眼球血眼屏障進入眼底到達視網膜組織。 2.成功構建視網膜缺血