NYD-SP15在年齡相關(guān)性黃斑變性中的作用研究.pdf

1、在年齡相關(guān)性黃斑變性(AMD)的發(fā)病過程中，視網(wǎng)膜色素上皮(RPE)細(xì)胞漸進(jìn)性功能障礙或凋亡起著至關(guān)重要的作用。NYD-SP15是胞苷脫氨酶家族成員之一，具有潛在地抑制細(xì)胞增殖的功能。最近發(fā)現(xiàn)該基因在RPE細(xì)胞中呈內(nèi)源性低表達(dá)，但是具體功能尚不清楚。
　　目的:
　　初步研究NYD-SP15對ARPE-19細(xì)胞的功能影響及作用機(jī)制，為探求NYD-SP15在AMD發(fā)生發(fā)展的作用提供基礎(chǔ)。
　　方法:
　　構(gòu)建慢病毒

2、穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的NYD-SP15過表達(dá)及干擾ARPE-19細(xì)胞系，通過CCK-8法、體外創(chuàng)傷劃痕愈合實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞術(shù)及caspase-3、caspase-8、caspase-9蛋白活性水平檢測研究其增殖、遷移能力以及凋亡情況。通過基因芯片初步研究NYD-SP15過表達(dá)ARPE-19絀胞系的全基因組變化及生物學(xué)功能。利用過氧化氫誘導(dǎo)NYD-SP15干擾ARPE-19細(xì)胞系的氧化應(yīng)激損傷模型，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡水平及細(xì)胞內(nèi)ROS含量。蛋白

3、印跡實(shí)驗(yàn)檢測Akt通路、MAPKs通路和Keap-1/Nrf2/HO-1通路蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果:
　　成功構(gòu)建并鑒定慢病毒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的NYD-SP15過表達(dá)及干擾的ARPE-19細(xì)胞系。NYD-SP15過表達(dá)ARPE-19細(xì)胞系的細(xì)胞增殖、遷移能力較對照組明顯減慢，細(xì)胞周期S期到G2/M期阻滯，并出現(xiàn)明顯的細(xì)胞凋亡，伴caspase-3和caspase-9通路活化增加?；蛐酒Y(jié)果發(fā)現(xiàn)，NYD-SP15過表達(dá)ARPE-1

4、9細(xì)胞與對照組相比，有254個(gè)基因下調(diào)，僅57個(gè)基因上調(diào)，呈現(xiàn)普遍全基因組表達(dá)受抑制現(xiàn)象。GO分析發(fā)現(xiàn)NYD-SP15可能影響ARPE-19細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能，而信號通路分析篩選出Akt以及MAPKs通路可能是NYD-SP15行使其負(fù)調(diào)控功能的主要通路。蛋白免疫印跡結(jié)果表明NYD-SP15過表達(dá)能明顯地抑制ARPE-19細(xì)胞中Akt及MAPKs通路蛋白Erk1/2、p-38和JNK的表達(dá)水平。此外，正常培養(yǎng)的NYD-SP15干擾AR

5、PE-19細(xì)胞增殖能力及細(xì)胞周期沒有明顯變化，但是在饑餓條件下細(xì)胞增殖活性增加。而經(jīng)過氧化氫誘導(dǎo)氧化應(yīng)激損傷后，與對照組相比，干擾組細(xì)胞生存率提高，且細(xì)胞內(nèi)ROS水平降低，提示細(xì)胞抗氧化應(yīng)激能力增強(qiáng)。蛋白免疫印跡結(jié)果發(fā)現(xiàn)NYD-SP15干擾組細(xì)胞中，核Nrf2及HO-1蛋白表達(dá)明顯增加，Akt、Erk1/2及p38活化水平明顯增加，而JNK活化水平降低。
　　結(jié)論:
　　NYD-SP15能夠明顯地抑制Akt或MAPKs通路蛋