補(bǔ)腎益精方促進(jìn)自身骨髓干細(xì)胞修復(fù)干性年齡相關(guān)性黃斑變性的作用研究.pdf

1、目的:
　　干性年齡相關(guān)性黃斑變性(age-related macular degeneration，AMD)是發(fā)達(dá)國(guó)家65歲以上人群主要的致盲性眼病，屬于視網(wǎng)膜退行性疾病的范疇，此類疾病的病理基礎(chǔ)是視網(wǎng)膜神經(jīng)元細(xì)胞的不可逆性損傷，目前臨床尚無(wú)有效的治療手段。近年細(xì)胞替代治療方法的出現(xiàn)，使視網(wǎng)膜退行性病變的修復(fù)成為可能。最新研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)動(dòng)員機(jī)體自身骨髓來(lái)源細(xì)胞(bone marrow stem cells，BMCs)亦可達(dá)到修復(fù)

2、組織損傷的作用，相比傳統(tǒng)的骨髓干細(xì)胞移植方法更加安全易行。因此，促進(jìn)自身BMCs動(dòng)員及其在病變處的歸巢、定向分化很可能成為干細(xì)胞治療的新途徑。補(bǔ)腎益精方（BSYJ方）是我們臨床常用的治療干性AMD的基本方，前期臨床觀察發(fā)現(xiàn)其能顯著改善患者視功能。中醫(yī)理論中的“精”在內(nèi)涵和功能上與干細(xì)胞具有相似性?；谝陨显颍狙芯繑M探討補(bǔ)腎益精方促進(jìn)自身BMCs修復(fù)干性AMD損傷的作用及可能機(jī)制。
　　方法:
　　1.以碘酸鈉誘導(dǎo)的干性A

3、MD小鼠模型作為研究載體，將模型動(dòng)物隨機(jī)分為中藥組及蒸餾水對(duì)照組（對(duì)照組），中藥組每日予BSYJ方灌胃，對(duì)照組以蒸餾水灌胃，以未造模的正常動(dòng)物為正常對(duì)照（正常組），常規(guī)飼養(yǎng)。碘酸鈉造模小鼠于造模后第一天給藥，給藥7天、14天、28天后觀察視網(wǎng)膜電圖(electroretinogram，ERG)和組織病理學(xué)指標(biāo)。
　　2.造模、分組、給藥方法同上。分別于治療后7天、14天、28天處死動(dòng)物，眼眶取血，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)外周血液中Lin

4、-/Sca-1+/c-kit+細(xì)胞數(shù)量。同時(shí)，用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)方法檢測(cè)粒細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte colony stimulating factor，G-CSF)、基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1α(stromal cellderived factor-1，SDF-1α)及其受體趨化因子受體-4（CXC chemokine receptor4，CXC

5、R-4）的含量。
　　3.造模、分組、給藥方法同上。造模后第1天，移植綠色熒光蛋白(green fluorescentprotein，GFP)轉(zhuǎn)基因小鼠（遺傳背景為C57/BL6小鼠）的BMCs。每只小鼠經(jīng)尾靜脈注射細(xì)胞數(shù)3×106，次日開(kāi)始治療。分別于治療后7天、14天、28天處死小鼠，眼眶取血，視網(wǎng)膜組織勻漿，采用ELISA方法檢測(cè)外周血及視網(wǎng)膜組織SDF-1α、CXCR-4含量。取小鼠眼球，分離視網(wǎng)膜-脈絡(luò)膜-鞏膜復(fù)合體，放

6、射狀切開(kāi)鋪片，激光共聚焦顯微鏡下觀察攜帶GFP的BMCs在整個(gè)視網(wǎng)膜的分布情況。取小鼠視網(wǎng)膜，采用Western-Blotting方法半定量觀察視網(wǎng)膜細(xì)胞間黏附因子(intercellular adhesion molecule1，ICAM-1)以及粘纖連蛋白（fibronectin，F(xiàn)N）的蛋白水平。
　　4.造模、分組、給藥方法同上，分別于治療后7天、14天、28天利用RT-PCR檢測(cè)視網(wǎng)膜睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（ciliary n

7、eurotrophic factor，CNTF），成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（basic fibroblast growth factor，bFGF），腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(brain derived neurotrhophicfactor，BDNF) mRNA表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1.與正常組比較，造模后對(duì)照組和中藥組ERG各項(xiàng)指標(biāo)均顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。治療7d、14d、28d后，與對(duì)照組比較，中藥組明視條

8、件ERG潛伏期a、潛伏期b、振幅b顯著改善，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。治療14d和28d后，與對(duì)照組比較，中藥組明視條件ERG振幅a顯著改善，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。治療28d后，與對(duì)照組比較，中藥組暗適應(yīng)條件ERG振幅a、振幅b，最大混合反應(yīng)振幅a、振幅b，振蕩電位振幅Toal，30Hz閃爍光振幅顯著改善，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。治療14d和28d后，視網(wǎng)膜感光細(xì)胞形態(tài)和數(shù)量顯著改善，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意

9、義(P＜0.05)。
　　2.治療7d后，中藥組外周血Lin-/Sca-1+/c-kit+細(xì)胞相對(duì)數(shù)量與對(duì)照組和正常組比較顯著增高(P＜0.05)。治療7d、14d和28d后，中藥組外周血G-CSF、SDF-1α及其受體CXCR-4含量與對(duì)照組相比顯著增加(P＜0.05)。
　　3.治療7d、14d和28d后，中藥組視網(wǎng)膜組織歸巢GFP-BMCs數(shù)量較對(duì)照組組顯著增加（P≤0.01）。治療14d和28d后，對(duì)照組外周血和中藥

10、組視網(wǎng)膜組織SDF-1α及CXCR-4含量較對(duì)照組顯著增加（P＜0.01）。治療7d、14d、28d后，視網(wǎng)膜組織ICAM-1表達(dá)顯著增加(P＜0.05)。治療14d和28d后，視網(wǎng)膜組織FN表達(dá)顯著增加(P＜0.05)。
　　4.治療7d，14d和28d，與對(duì)照組比較，視網(wǎng)膜組織中CNTF mRNA表達(dá)均顯著增加(P＜0.05)。治療14d和28d后，視網(wǎng)膜組織BDNF和bFGFmRNA表達(dá)顯著增加（P＜0.05）。
　　

11、結(jié)論:
　　1.BSYJ方對(duì)干性AMD具有保護(hù)作用，能延緩干性AMD疾病的進(jìn)程。
　　2.BSYJ方對(duì)碘酸鈉誘導(dǎo)干性AMD小鼠BMCs具有動(dòng)員、遷移作用，這可能與增加相關(guān)細(xì)胞因子C-GSF含量，啟動(dòng)SDF-1α/CXCR-4信號(hào)軸有關(guān)。
　　3.BSYJ方能促進(jìn)BMCs向損傷的視網(wǎng)膜歸巢，這可能與其能增加黏附分子ICAM-1和FN的表達(dá)有關(guān)。
　　4.BSYJ方能延緩干性AMD病理改變，這可能與促進(jìn)BMCs歸巢和