扶正消瘤顆?？筂CF-7耐藥細(xì)胞體外增殖及機(jī)理研究.pdf

1、目的：乳腺癌為嚴(yán)重危害全球女性健康的惡性腫瘤,全球每年約有100萬婦女患乳腺癌,約有40萬人死于該病,其發(fā)病率逐年上升,且年齡趨于年輕化。發(fā)達(dá)國(guó)家為乳腺癌高發(fā)區(qū),我國(guó)雖屬乳腺癌低發(fā)地區(qū),但發(fā)病率仍居女性惡性腫瘤首位。21世紀(jì),我國(guó)乳腺癌發(fā)病率城市高于農(nóng)村,經(jīng)濟(jì)發(fā)達(dá)地區(qū)的發(fā)病率更高。手術(shù)、放療、化療、內(nèi)分泌、生物治療及中醫(yī)中藥治療為當(dāng)今乳腺癌的主要治療方法,化療在其中占重要地位,而乳腺癌細(xì)胞對(duì)化療藥物耐藥已為乳腺癌治療不能取得治愈性療效的

2、最主要原因。近10年來,許多學(xué)者致力于乳腺癌的多藥耐藥性研究,發(fā)現(xiàn)乳腺癌多藥耐藥基因(MDR1)及其編碼的糖蛋白(P—gp)是引起乳腺癌耐藥的主要原因。
　　 因此,尋找耐藥逆轉(zhuǎn)劑、增強(qiáng)化療療效是腫瘤化療急需解決的重大課題。大量逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥的研究發(fā)現(xiàn)鈣通道阻滯劑、免疫調(diào)節(jié)劑、鈣調(diào)蛋白拮抗劑等藥具有逆轉(zhuǎn)耐藥活性,但因療效欠佳、作用靶點(diǎn)單一、毒副作用大等缺點(diǎn)難以應(yīng)用于臨床。中藥復(fù)方因療效確切、多靶點(diǎn)、毒副作用小等優(yōu)點(diǎn),具有很大的研究

3、價(jià)值。從中藥復(fù)方中尋找安全有效的耐藥逆轉(zhuǎn)劑逐漸成為當(dāng)今研究熱點(diǎn)。
　　 中藥復(fù)方體外藥理研究的發(fā)展,復(fù)方中藥含藥血清理論的提出為深入研究復(fù)方中藥抗腫瘤機(jī)制開辟了新的出路。血清藥理學(xué)是指將中藥或中藥復(fù)方經(jīng)口給動(dòng)物灌服一定時(shí)間后采集動(dòng)物血液、分離血清,用含有藥物成分的血清進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)的一種半體內(nèi)實(shí)驗(yàn)方法。該方法主要有兩個(gè)特點(diǎn):一是克服了用中藥制劑直接進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)時(shí),中藥制劑本身的理化性質(zhì)對(duì)實(shí)驗(yàn)的干擾；二是實(shí)驗(yàn)結(jié)果與在體實(shí)驗(yàn)有較好的一

4、致性,不僅能反映中藥母體藥物及其可能的代謝產(chǎn)物的藥理作用,而且還能反映可能藥物誘導(dǎo)機(jī)體內(nèi)源性成分所產(chǎn)生的作用,為從細(xì)胞分子水平研究中藥藥理學(xué)作用提供了新的手段。
　　 中醫(yī)學(xué)認(rèn)為,乳腺癌屬“乳巖”范疇,多表現(xiàn)為虛實(shí)夾雜證,表現(xiàn)為氣、血、陰、陽不足,以及痰濁、瘀血、熱毒夾雜作用的結(jié)果。惡性腫瘤本為正氣虛損、陰陽失衡、臟腑功能失調(diào)所致,手術(shù)、放療、化療進(jìn)一步損耗氣血,正氣受創(chuàng)。遂治療上宜扶正培本,去除邪毒,改善機(jī)體內(nèi)環(huán)境,減輕放化療

5、毒副反應(yīng)及手術(shù)對(duì)機(jī)體免疫功能的抑制,調(diào)補(bǔ)先后天之本,調(diào)動(dòng)和增強(qiáng)機(jī)體自身抗癌能力。大量研究證實(shí)許多中藥及復(fù)方具抗腫瘤活性,不僅能提高機(jī)體免疫功能,還能抑制癌細(xì)胞的分裂,改善癥狀,提高患者的生存質(zhì)量,延長(zhǎng)生存期。
　　 針對(duì)乳腺癌本虛標(biāo)實(shí)的病機(jī),導(dǎo)師結(jié)合多年臨床經(jīng)驗(yàn),擬制中藥復(fù)方扶正消瘤顆粒,功以益氣養(yǎng)陰扶正,解毒散結(jié)、祛瘀化痰消瘤,對(duì)乳腺癌術(shù)后放化療增效、減輕并發(fā)癥、增強(qiáng)免疫力,延緩腫瘤轉(zhuǎn)移具有較好的療效。方中以西洋參、靈芝、百合

6、、黃芪益氣養(yǎng)陰,清熱生津；增強(qiáng)患者脾胃運(yùn)化功能,補(bǔ)益中氣；薏苡仁、豬苓、法半夏、陳皮化痰祛濕濁,助脾胃運(yùn)化；三棱、莪術(shù)活血祛瘀,使瘀血去則新血生,即祛瘀生新之功；半枝蓮、白花蛇舌草、山慈菇、黃藥子解毒散結(jié)消瘤,清除余毒；諸藥共用,益氣健脾養(yǎng)陰,扶正固本,化痰祛瘀,解毒消瘤而達(dá)到增強(qiáng)免疫、減毒增效的作用。
　　 本實(shí)驗(yàn)通過研究扶正消瘤顆粒含藥血清對(duì)乳腺癌細(xì)胞MCF-7耐藥細(xì)胞體外增殖及機(jī)理的研究,為深入研究扶正消瘤顆粒臨床療效的作

7、用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
　　 方法：
　　 1、采用濃度梯度試驗(yàn)誘導(dǎo)法,應(yīng)用聯(lián)合化療藥物(紫杉醇和表柔比星的最高血藥濃度,PPC)誘導(dǎo)耐藥MCF-7/ADM多藥耐藥,并研究MCF-7多耐藥細(xì)胞的基本性狀、細(xì)胞生長(zhǎng)曲線及MCF-7對(duì)聯(lián)合化療藥物的最大耐藥濃度；
　　 2、采用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)常用的等效劑量折算系數(shù)公式,折算大鼠每日給藥量。將扶正消瘤顆粒劑用溫水配制成三種不同的倍數(shù)濃度即1倍量、2倍量、3倍量,對(duì)照組予生理鹽水,連

8、續(xù)灌胃3天,最后1次灌胃結(jié)束后60～120分鐘,行下腔靜脈采血制備血清；
　　 3、MTT法檢測(cè)。設(shè)空白組(SFM+耐藥細(xì)胞+0.35PPC,Blnak)、1倍劑量組(SFM+耐藥細(xì)胞+1FZXL+0.35PPC,1FZXL)、2倍劑量組(SFM+耐藥細(xì)胞+2FZXL+0.35PPC,2FZXL)、3倍劑量組(SFM+耐藥細(xì)胞+3FZXL+0.35PPC,3FZXL)；四唑鹽比色法(MTT法)測(cè)定扶正消瘤顆粒含藥血清抗MCF-7

9、多藥耐藥細(xì)胞的體外增殖作用；各組分別于培養(yǎng)3、4、5、6、7天五個(gè)時(shí)間點(diǎn)行MTT法檢測(cè)細(xì)胞吸光值(OD),比較各組間的差異；
　　 4、用RT—PCR法分別測(cè)定不同含藥血清作用后耐藥細(xì)胞的多藥耐藥基因MDR1的表達(dá)陽性率；設(shè)陰性對(duì)照MCF-7/S,陽性對(duì)照MCF-7/ADM耐藥細(xì)胞及實(shí)驗(yàn)組Blank、1FZXL、2FZXL、3FZXL連續(xù)培養(yǎng)7天,采用Trizol試劑提取各組總RNA,PCR反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性2min,進(jìn)入循

10、環(huán)94℃30s,55℃30s,72℃60s,共35個(gè)循環(huán),最后72℃延伸10min,2％瓊脂糖凝膠電泳分離,溴化乙錠染色,紫外凝膠成像系統(tǒng)掃描,并用Gelbase電腦軟件進(jìn)行光密度分析,計(jì)算MDR1mRNA的相對(duì)含量。
　　 5、用WESTERN(蛋白印記)法測(cè)定敏感細(xì)胞和不同含藥血清作用后耐藥細(xì)胞P-GP的陽性表達(dá)。取實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)后7d的細(xì)胞(每組細(xì)胞約1×107個(gè)),加入細(xì)胞裂解液,冰浴上超聲粉碎；取出上清液(蛋白),分光光度計(jì)

11、下測(cè)量樣品的純度；取蛋白樣品各100ug上樣,經(jīng)SDS-PAGE電泳進(jìn)行蛋白轉(zhuǎn)膜,加入5％脫脂奶粉封阻90分鐘,加入一抗P-gp(1:160)4℃過夜,TTBS洗膜15min×3次,加二抗37℃40分鐘,TTBS洗膜15分鐘×3次,加辣根過氧化物酶37℃40分鐘,TTBS洗膜15分鐘×3次,DAB顯色。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,UVP凝膠成像系統(tǒng)掃描成像,比較各條帶的吸光度值。
　　 統(tǒng)計(jì)方法：
　　 1、統(tǒng)計(jì)描述:計(jì)量資料數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

12、用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)；
　　 2、統(tǒng)計(jì)推斷:計(jì)量資料的比較用one-way ANOVA,多組率的比較用KIndependent Sample Test檢驗(yàn)；
　　 3、采用SPSS13.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,P<0.05為統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)有顯著性差異。
　　 結(jié)果：
　　 1、乳腺癌耐藥細(xì)胞MCF-7/ADM對(duì)聯(lián)合化療藥的耐藥作用具有一定耐受作用；x2=14.965,V=5,P=0.011,P<0.

13、05,各組不同PPC對(duì)MCF-7/ADM細(xì)胞抑制率有顯著差異,據(jù)平均秩次進(jìn)一步推斷,1.0ppc抑制效果最好,0.5ppc效果次之,0.1ppc抑制效果最差。從0.1PPC～0.35PPC4組比較中,可知x2=6.846,v=3,P=0.077,4組間細(xì)胞抑制率分布無顯著性差異,即認(rèn)為聯(lián)合化療藥物在0.1PPC～0.35PPC濃度范圍內(nèi)對(duì)MCF-7/ADM耐藥細(xì)胞增殖影響無顯著差異；說明MCF-7/ADM耐藥細(xì)胞對(duì)聯(lián)合化療藥物濃度(PP

14、C)的最大耐藥濃度為0.35PPC。
　　 2、較大劑量扶正消瘤顆粒含藥血清有明顯的抑制MCF-7耐藥細(xì)胞增殖作用；比較各組細(xì)胞增殖抑制率可知,NFZXL、1FZXL、2FZXL、3FZXL四組細(xì)胞抑制率有顯著差異(x2=16.129,v=3,P=0.001),且2FZXL組效果最好,3FZXL組效果次之,1FZXL組再次之,NFZXL最差(平均秩次依次為15.9、15.10、8.0、3.0)；兩兩比較,2FZXL與3FZXL兩

15、組抑制率差異無顯著性(U統(tǒng)計(jì)量為10.50,W為25.50,Z=-0.419,P=0.690)。說明扶正消瘤顆粒加倍量對(duì)MCF-7耐藥細(xì)胞增殖具更明顯抑制作用,即可明顯增強(qiáng)MCF-7耐藥細(xì)胞對(duì)聯(lián)合化療藥物的敏感性。
　　 3、扶正消瘤顆粒含藥血清可通過下調(diào)MCF-7耐藥細(xì)胞的多耐藥基因MDR1的轉(zhuǎn)錄及P—gp蛋白的表達(dá)抑制細(xì)胞增殖作用。RT—PCR檢測(cè)結(jié)果顯示,2FZXL(1.05±0.01)與3FZXL(1.06±0.02)兩

16、組與MCF-7/ADM(2.08±0.03)細(xì)胞組相比,P<0.05,可信區(qū)間分別為(0.982,1.078)和(0.972,1.068),差異有顯著意義,可認(rèn)為2FZXL和3FZXL兩組多藥耐藥基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平較MCF-7/ADM組有明顯下降；NFZXL(2.01±0.04)組MCF-7/ADM相比,P=0.114,兩組差異無顯著意義,說明2FZXL和3FZXL兩組含藥血清有下調(diào)MDR1 mRNA轉(zhuǎn)錄的作用；在P-gp糖蛋白的表達(dá)

17、水平比較中,2FZXL和3FZXL兩組的表達(dá)水平均較MCF-7/ADM組有明顯下降,P<0.05,可信區(qū)間分別為(4.51,13.95)和(4.04,13.48)。認(rèn)為兩組均可下調(diào)乳腺癌MCF-7耐藥細(xì)胞P-gp糖蛋白的表達(dá)；說明2FZXL及3FZXL組含藥血清均可通過下調(diào)MDR1 mRNA轉(zhuǎn)錄及P-gp糖蛋白的表達(dá)而達(dá)到抑制耐藥細(xì)胞增殖。
　　 結(jié)論：
　　 1、乳腺癌耐藥細(xì)胞MCF-7/ADM對(duì)紫杉醇和表阿霉素聯(lián)合化