BDNF通過(guò)上調(diào)Rab8-GTP水平調(diào)控突觸后膜AMPA受體的局部運(yùn)輸.pdf

1、目的及背景:
　　腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(Brain-derived neurotrophic factor, BDNF)作為神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子中的重要成員，不僅能促進(jìn)神經(jīng)元的存活與分化，樹(shù)突和軸突的生長(zhǎng)，而且在調(diào)節(jié)突觸可塑性過(guò)程中起到關(guān)鍵作用。突觸可塑性通常被認(rèn)為是學(xué)習(xí)與記憶的分子基礎(chǔ)，在神經(jīng)元信息傳遞過(guò)程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。在突觸前膜，BDNF通過(guò)調(diào)控膜泡分泌促進(jìn)遞質(zhì)釋放實(shí)現(xiàn)對(duì)突觸前膜可塑性的調(diào)節(jié);而在突觸后膜，BDNF往往是通過(guò)調(diào)控

2、離子型谷氨酸受體，特別是AMPA受體(Alpha-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole propionic acid receptors)的分布和數(shù)量來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)突觸后膜可塑性的調(diào)控。樹(shù)突棘(spine)是神經(jīng)元的特化結(jié)構(gòu)，分布于神經(jīng)元的樹(shù)突上，一般呈蘑菇頭狀。樹(shù)突棘中有突觸后致密質(zhì)，是突觸后膜的特化結(jié)構(gòu)，樹(shù)突棘可以與突觸前膜和突觸間隙組成一個(gè)完整的突觸結(jié)構(gòu)，介導(dǎo)化學(xué)信號(hào)的傳導(dǎo)。雖然已有文獻(xiàn)報(bào)道BDNF可

3、以上調(diào)AMPA受體在神經(jīng)元整體膜表面的含量，但是BDNF是否能調(diào)控AMPA受體在spine部位的膜表面含量，還有待進(jìn)一步研究。
　　小GTP酶蛋白中的Rab家族參與細(xì)胞內(nèi)的膜泡運(yùn)輸過(guò)程，那么Rab分子是否也能參與調(diào)控突觸后膜，特別是spine處細(xì)胞內(nèi)的膜泡運(yùn)輸過(guò)程呢？目前研究報(bào)道Rab8參與調(diào)控細(xì)胞內(nèi)膜泡從高爾基體TGN區(qū)運(yùn)往細(xì)胞膜的過(guò)程，對(duì)神經(jīng)元的極性運(yùn)輸起著關(guān)鍵作用。且有研究證實(shí)，Rab8在AMPA受體運(yùn)往spine膜表面的過(guò)

4、程中是必要的，特別是在AMPA受體上膜的過(guò)程至關(guān)重要。然而，在BDNF調(diào)控AMPA受體在突觸后膜的運(yùn)輸過(guò)程中，Rab8是否參與以及如何發(fā)揮作用，目前尚不清楚。本文采用分子細(xì)胞學(xué)方法證實(shí)BDNF能夠通過(guò)增加Rab8-GTP的含量從而特異性上調(diào)GluA1（AMPA受體的一種亞基）在spine膜表面的分布，而且這個(gè)過(guò)程是由PLCγ-Rabin3信號(hào)介導(dǎo)實(shí)現(xiàn)的。本研究將為人們闡明學(xué)習(xí)與記憶的具體分子機(jī)制提供一個(gè)新的角度。
　　方法:

5、>　　1.各種表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建。
　　2.海馬神經(jīng)元的培養(yǎng)及其轉(zhuǎn)染。
　　3.免疫熒光定量檢測(cè)AMPA受體在spine處的膜表面水平。
　　4.胞漿蛋白與膜蛋白的分離。
　　5.GST-pull down及Western Blot。
　　結(jié)果:
　　1.BDNF調(diào)控GluA1在spine處的膜表面水平。
　　通過(guò)免疫熒光的實(shí)驗(yàn)方法，我們發(fā)現(xiàn)給予培養(yǎng)神經(jīng)元BDNF刺激30 min，不僅能夠顯著升高s

6、pine處GluA1蛋白的整體水平，同時(shí)還能上調(diào)spine膜表面GluA1蛋白的含量。
　　2.BDNF不影響GluA2在spine處的膜表面水平。
　　通過(guò)免疫熒光的實(shí)驗(yàn)方法，我們發(fā)現(xiàn)給予培養(yǎng)神經(jīng)元BDNF刺激30 min，雖然能夠顯著升高spine處GluA2蛋白的整體水平，卻不影響spine膜表面GluA2蛋白的含量。
　　3.BDNF通過(guò)影響Rab8形式轉(zhuǎn)換上調(diào)GluA1在spine膜表面的分布。
　　通

7、過(guò)免疫熒光的方法，我們發(fā)現(xiàn)在過(guò)表達(dá)Rab8功能缺失突變體(Rab8dn)后，BDNF不再上調(diào)GluA1蛋白在spine膜表面的含量;過(guò)表達(dá)Rab11功能缺失突變體(Rab11dn)后，BDNF不能上調(diào)spine處GluA1蛋白的整體水平。
　　4.BDNF上調(diào)Rab8-GTP水平。
　　通過(guò)胞漿-膜蛋白分離及GST pull down兩種實(shí)驗(yàn)方法，我們發(fā)現(xiàn)給予培養(yǎng)神經(jīng)元BDNF刺激30 min后能夠顯著上調(diào)神經(jīng)元中Rab8-

8、GTP的蛋白水平。
　　5.BDNF通過(guò)Rabin3蛋白上調(diào)Rab8-GTP的蛋白水平。
　　通過(guò)GST-JFC1 pull down方法，我們發(fā)現(xiàn)干擾掉Rabin3后，BDNF不再上調(diào)Rab8-GTP。
　　6.BDNF通過(guò)TrkB-PLCγ-PKC信號(hào)通路上調(diào)Rab8-GTP的蛋白水平。
　　通過(guò)GST-JFC1 pull down方法，我們發(fā)現(xiàn)在給予Trk激酶的抑制劑K252a，PLCγ信號(hào)通路抑制劑U73

9、122和PKC信號(hào)通路抑制劑CHE時(shí)，BDNF不再上調(diào)Rab8-GTP。
　　7.BDNF通過(guò)PLCγ-Rabin3信號(hào)通路上調(diào)Rab8-GTP的蛋白水平。
　　通過(guò)GST-JFC1 pull down實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)干擾掉Rabin3，再給予PKC信號(hào)通路的激動(dòng)劑后，BDNF不再上調(diào)神經(jīng)元中Rab8-GTP的蛋白水平。
　　結(jié)論:
　　通過(guò)一系列的細(xì)胞分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法，我們證實(shí)了BDNF能夠通過(guò)上調(diào)Rab8-G