天然產(chǎn)物Britanin的靶標發(fā)現(xiàn)及神經(jīng)保護作用研究.pdf

1、1、研究目的:
　　人體活性氧水平的不斷增加，會打破氧化還原平衡狀態(tài)，引起氧化應(yīng)激反應(yīng)。氧化應(yīng)激在神經(jīng)退行性疾病、組織器官損傷和自身免疫病等一系列疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的作用。在腦缺血再灌注過程中，腦組織內(nèi)活性氧(reactive oxygenspecies，ROS)水平會大量升高，進而引起腦組織損傷。因此，通過提高機體抗氧化水平降低機體氧化應(yīng)激壓力，成為腦卒中治療的一條重要途徑。
　　Nrf2(nuclear facto

2、r erythroid2-related factor2)信號通路是機體抵抗氧化壓力的最重要途徑之一。通過激活Nrf2信號通路，可以增強機體抵抗氧化損傷的能力。因此，激活Nrf2信號通路成為針對多種退行性疾病和慢性疾病的治療途徑。靶向Nrf2信號通路是開發(fā)針對神經(jīng)退行性疾病和慢性疾病治療藥物的新研究方向。
　　天然產(chǎn)物來源豐富，藥理藥效開發(fā)潛能具大?；仡櫿麄€藥物研究的歷史，天然產(chǎn)物一直在其中發(fā)揮著舉足輕重的作用，貢獻了諸多療效明確

3、、不可或缺的藥物。天然產(chǎn)物Britanin是一個倍半萜內(nèi)酯類化合物，廣泛分布于菊科旋覆花屬植物中。本課題通過構(gòu)建體外神經(jīng)細胞損傷模型，研究Britanin的神經(jīng)保護作用。為了闡明Britanin發(fā)揮神經(jīng)保護作用的機制，我們開展了Britanin對氧化應(yīng)激和Nrf2信號通路的調(diào)控作用的研究。期望能夠發(fā)現(xiàn)Britanin調(diào)控Nrf2通路的分子靶標。最終，通過構(gòu)建實驗性大鼠腦缺血再灌注損傷(Middle cerebral artery occ

4、lusion，MCAO)模型，評價Britanin在體內(nèi)水平發(fā)揮神經(jīng)保護作用的能力。綜合上述系列研究，為把Britanin開發(fā)成新穎的氧化應(yīng)激相關(guān)疾病治療藥物奠定臨床前研究基礎(chǔ)。
　　2、研究方法:
　　(1)體外神經(jīng)細胞損傷模型的構(gòu)建。參考目前神經(jīng)保護方面的研究進展，構(gòu)建了兩種體外神經(jīng)細胞損傷模型。分別是高濃度谷氨酸誘導PC12細胞損傷模型;氧和葡糖糖剝奪再補充(oxygen-glucose deprivation fol

5、lowed by reperfusion，OGD-R)誘導原代皮層神經(jīng)元損傷模型。在這兩種細胞模型基礎(chǔ)上，研究天然產(chǎn)物Britanin的神經(jīng)保護作用。
　　(2)研究Britanin對Nrf2信號通路的調(diào)控作用。天然產(chǎn)物Britanin可以保護神經(jīng)細胞，降低氧化應(yīng)激引起的細胞損傷。本研究在原代神經(jīng)元細胞水平上，采用ARE(antioxidant response element)報告基因?qū)嶒灐iRNA干擾實驗、實時熒光定量PCR

6、(Polymerase Chain Reaction)檢測實驗和蛋白免疫印跡實驗等方法，探究Britanin對Nrf2抗氧化信號通路的調(diào)控作用。
　　(3)驗證Britanin與靶標蛋白Keap1(Kelch-like ECH-associated protein1)的共價結(jié)合作用。Keap1蛋白是Nrf2蛋白的負性調(diào)控蛋白，通過結(jié)合Nrf2蛋白引起其泛素化修飾和程序性降解。本研究采用大腸桿菌原核表達系統(tǒng)，表達并純化人源Keap1

7、全長蛋白及其BTB結(jié)構(gòu)域。本課題組前期研究中，設(shè)計合成了生物素化修飾的Britanin小分子探針。在體外機制研究實驗中，本研究采用小分子探針Pull-down靶標蛋白Keap1的方法，初步確證二者之間的相互作用。為了進一步確證Britanin與靶標蛋白Keap1之間的結(jié)合位點，本研究采用LC-MS(liquid chromatograph-massspectrometer)分析方法，研究Britanin對Keap1蛋白序列中半胱氨酸的修

8、飾作用，確定共價結(jié)合位點。為了明確Britanin與Keap1蛋白BTB結(jié)構(gòu)域的結(jié)合模式，本研究開展了Britanin與靶標蛋白Keap1的復(fù)合物共結(jié)晶實驗。為了闡明Britanin激活Nrf2信號通路的分子機制，我們研究了Britanin對Nrf2蛋白泛素化水平的調(diào)控作用及調(diào)控機制。
　　(4)體內(nèi)構(gòu)建大鼠MCAO模型。與體外研究采用的OGD-R誘導原代皮層神經(jīng)元損傷模型相對應(yīng)，我們構(gòu)建了大鼠體內(nèi)MCAO模型，考察Britani

9、n在動物體內(nèi)發(fā)揮抗氧化和神經(jīng)保護作用的能力。
　　3、研究結(jié)果:
　　通過體外神經(jīng)細胞保護實驗，我們發(fā)現(xiàn)Britanin可以顯著的保護神經(jīng)細胞，降低氧化應(yīng)激誘導的細胞損傷。在這一過程中Britanin可以顯著下調(diào)神經(jīng)細胞受到損傷刺激時的ROS水平。
　　Nrf2信號通路是機體抵抗氧化壓力，維持氧化還原穩(wěn)態(tài)的最重要調(diào)節(jié)通路。通過報告基因?qū)嶒灪突蚋蓴_實驗，我們發(fā)現(xiàn)Britanin可以顯著激活Nrf2信號通路，提高Nrf2

10、信號通路下游抗氧化酶的表達水平，進而發(fā)揮神經(jīng)保護作用。
　　Keap1蛋白是Nrf2信號通路的負性調(diào)節(jié)蛋白，可能是Britanin的作用靶標。應(yīng)用小分子探針Pull-down實驗，我們確證了Britanin與靶標蛋白Keap1之間的相互作用。通過LC-MS聯(lián)用實驗，進一步找到了Britanin與Keap1之間的共價結(jié)合位點。通過復(fù)合物共結(jié)晶實驗，我們得到了Britanin與Keap1蛋白BTB結(jié)構(gòu)域的共結(jié)晶結(jié)構(gòu)，確證Britani

11、n通過邁克爾加成反應(yīng)共價結(jié)合于Keap1的151位半胱氨酸的結(jié)合模式。通過進一步的分子機制研究，我們發(fā)現(xiàn)Britanin通過靶向Keap1蛋白，干擾了Keap1與Cul3之間的相互作用，使Cul3不能進一步介導對Nrf2蛋白的泛素化修飾和蛋白酶體降解，進而激活Nrf2信號通路。
　　應(yīng)用大鼠急性腦缺血再灌注損傷模型，我們考察了Britanin在體內(nèi)提高機體抵抗氧化應(yīng)激，發(fā)揮神經(jīng)保護作用的能力。Britanin灌胃給藥可以激活Nrf

12、2通路，顯著降低腦組織梗死體積，改善行為學評分。
　　4、研究結(jié)論:
　　本課題發(fā)現(xiàn)天然產(chǎn)物Britanin通過靶向Keap1蛋白，激活Nrf2信號通路。Britanin是一個全新的Nrf2信號通路激動劑。通過共結(jié)晶結(jié)構(gòu)解析，揭示了Britanin與Keap1蛋白的結(jié)合模式，闡明了Britanin激活Nrf2信號通路的分子機制。通過體外神經(jīng)細胞保護模型和體內(nèi)大鼠腦缺血再灌注損傷模型，我們發(fā)現(xiàn)Britanin通過激活Nrf2信