天然產(chǎn)物EGCG對TP致免疫性肝損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）是一種從綠茶中分離得到的兒茶素類單體，具有抗炎和抗氧化等作用，可有效治療或緩解肝損傷，本課題擬用雷公藤甲素（TP）建立小鼠免疫性肝損傷模型，并以此探討EGCG對TP誘導(dǎo)的小鼠免疫性肝損傷的保護(hù)性作用和機(jī)制。
　　方法：
　　1.TP致小鼠免疫性肝損傷模型的構(gòu)建及鑒定。將20只雌性C57BL/6小鼠（體重18-20g）隨機(jī)分為兩組，分別設(shè)為正常組和TP模型組。TP模型組的小

2、鼠灌胃給予500μg/kg的TP，正常組同時(shí)給予等量的生理鹽水，22h后分別取血，處死，取肝儲存?zhèn)溆?。兩組小鼠分別采用賴氏法檢測血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）水平；并以HE染色法對各組小鼠肝臟組織形態(tài)學(xué)進(jìn)行對比觀測，再通過ELISA方法檢測肝臟白細(xì)胞介素（IL）-17和IL-10的表達(dá)水平；RT-PCR方法檢測肝臟中維甲酸孤兒核受體（ROR-γt）、叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子（Foxp3）mRNA表達(dá)水平；以證實(shí)小鼠免疫性肝損傷模型構(gòu)建成功。
　　

3、2.將40只雌性C57BL/6小鼠（體重18-20g）隨機(jī)分為四組，即正常組、EGCG處理組、TP模型組、EGCG治療模型組。EGCG處理組和EGCG治療模型組每天經(jīng)灌胃給予EGCG，劑量為5 mg/kg，每日兩次，共計(jì)給藥10天，正常組和TP模型組同時(shí)給予等量的生理鹽水。給藥10天后，TP模型組和EGCG治療模型組的小鼠灌胃給予500μg/kg的TP，正常組和EGCG組同時(shí)給予等量的生理鹽水，22h后取血，處死，取肝儲存?zhèn)溆?。采用賴?/p>

4、法檢測小鼠血清ALT水平；采用分光光度法檢測肝勻漿丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）和還原型谷胱甘肽（GSH）的變化水平；并以HE染色法對小鼠肝臟組織形態(tài)學(xué)進(jìn)行對比觀測，再通過ELISA方法檢測肝臟IL-17和IL-10的表達(dá)水平；RT-PCR方法檢測肝臟中ROR-γt、Foxp3、核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）和髓樣分化因子88（MyD88）mRNA表達(dá)水平；Western blotting方法檢測肝臟中T細(xì)胞免疫球蛋白黏蛋白

5、3（Tim3）和Toll樣受體4（TLR4）的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：
　　1.與正常組比較，TP模型組中小鼠血清ALT水平明顯升高（P＜0.005），肝臟病理切片顯示具有較多肝細(xì)胞壞死和中性粒細(xì)胞浸潤，提示TP造成了急性肝損傷；同時(shí)，肝臟中與Th17變化密切相關(guān)的IL-17及ROR-γt mRNA的水平也顯著升高（P＜0.005）；與Treg變化密切相關(guān)的IL-10及Foxp3 mRNA的水平明顯下降（P＜0.005），表明

6、TP誘導(dǎo)Th17/Treg失衡，成功構(gòu)建了TP致免疫性肝損傷模型。
　　2. EGCG治療模型組小鼠ALT水平與TP模型組相比明顯下降（P＜0.005）；肝臟病理切片顯示其肝細(xì)胞炎癥壞死程度與TP模型組相比也明顯減輕，提示了EGCG對TP誘導(dǎo)的急性肝損傷具有保護(hù)作用。TP模型組小鼠肝臟中MDA和IL-17的水平明顯高于正常組（P＜0.005）， SOD、GSH和IL-10的水平與正常組相比顯著下降（SOD P＜0.05;GSH、I

7、L-10 P＜0.005）；而EGCG治療模型組小鼠肝臟MDA、IL-17水平均明顯下調(diào)（P＜0.005），SOD、GSH和IL-10表達(dá)水平增高，與TP模型組比較有顯著性差異（SOD, P＜0.05;GSH、IL-10 P＜0.005）。TP模型組小鼠肝臟中ROR-γt、NF-κB及MyD88 mRNA的水平明顯高于正常組（P＜0.005），而Foxp3 mRNA的水平明顯低于正常組（P＜0.005）；EGCG治療模型組小鼠肝臟ROR

8、-γt、NF-κB及MyD88 mRNA的水平均顯著降低（P＜0.005），而Foxp3 mRNA水平表達(dá)上調(diào)，與TP模型組比較有顯著性差異（P＜0.005）。TP模型組小鼠肝臟Tim3蛋白表達(dá)水平低于正常組（P＜0.005），而TLR4蛋白水平高于正常組（P＜0.005）， EGCG治療模型組小鼠Tim3蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05），而TLR4水平明顯降低（P＜0.05）。其中，氧化指標(biāo)MDA、SOD、GSH的改變表明EGCG

9、具有抗氧化作用；IL-17、IL-10、ROR-γt、Foxp3的改變提示EGCG糾正了TP誘導(dǎo)的Th17/Treg失衡；Tim3、TLR4、NF-κB、MyD88的變化顯示EGCG糾正Th17/Treg失衡的機(jī)制。
　　結(jié)論：
　　1. TP致小鼠免疫性肝損傷模型構(gòu)建成功。
　　2. EGCG通過其抗氧化作用及對Th17/Treg失衡的調(diào)節(jié)作用來保護(hù)TP所致的小鼠免疫性肝損傷。
　　3. EGCG的免疫保護(hù)機(jī)制