Nrf2調(diào)控小鼠紋狀體EAAC1和xCT在錳致神經(jīng)毒性影響中的實驗研究.pdf

1、目的:錳是一種重要的工業(yè)和環(huán)境化學(xué)污染物，人類可以通過在職業(yè)暴露、環(huán)境接觸及飲食飲水等途徑接觸神經(jīng)毒物錳。進(jìn)入機(jī)體的錳易通過血腦屏障在腦內(nèi)紋狀體等部位蓄積，導(dǎo)致紋狀體氧化損傷進(jìn)而引起紋狀體病變。多年來國內(nèi)外許多學(xué)者對錳進(jìn)行了廣泛且深入的研究，已有研究證明氧化損傷是錳致神經(jīng)毒性的重要機(jī)制之一，主要原因是氧自由基產(chǎn)生的細(xì)胞毒性效應(yīng)。谷胱甘肽是體內(nèi)最早發(fā)現(xiàn)具有重要生理性功能且有活性的三肽，是腦內(nèi)最有效的抗氧化分子。錳中毒時，谷胱甘肽濃度下降導(dǎo)

2、致腦紋狀體對氧化應(yīng)激極為敏感，可致紋狀體抗氧化系統(tǒng)失衡，從而引起氧化損傷。EAAC1（Excitatory amino acid carrier-1，EAAC1）主要分布于神經(jīng)元，在神經(jīng)系統(tǒng)中具有將細(xì)胞外谷氨酸和胱氨酸轉(zhuǎn)入胞內(nèi)的雙重作用，能促進(jìn)神經(jīng)元谷胱甘肽合成。谷氨酸/胱氨酸轉(zhuǎn)運體是一種跨膜氨基酸轉(zhuǎn)運體，可1∶1攝取胱氨酸、排出谷氨酸，攝入的胱氨酸被還原為半胱氨酸后，參與谷胱甘肽合成。近年來，一類具有抗氧化應(yīng)激特征的轉(zhuǎn)錄因子Nrf2信

3、號通路引起了國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注，其激活障礙或缺失將會抑制下游抗氧化的基因水平表達(dá)，從而組織氧化損傷。目前研究發(fā)現(xiàn)Nrf2信號通路通過啟動神經(jīng)元EAAC1和xCT的表達(dá)而促進(jìn)GSH合成，主要原因是因為在EAAC1的啟動子上具有ARE的相關(guān)序列且在小鼠xCT基因的啟動子區(qū)域已鑒定至少4種ARE基序。但是，目前應(yīng)用Nrf2誘導(dǎo)紋狀體EAAC1、xCT調(diào)控GSH合成在錳致神經(jīng)毒性中的研究還鮮有報道。本研究旨在觀察不同濃度Mn暴露對紋狀體GSH

4、含量及EAAC1和xCT功能和表達(dá)的影響，給予不同濃度的Nrf2激活劑萊菔硫烷和抑制劑異煙肼，從正反兩個角度來研究Nrf2信號通路在Mn影響EAAC1和xCT調(diào)控GSH合成中的作用及分子機(jī)制，為深入研究Nrf2對錳致小鼠紋狀體EAAC1和xCT的影響提供實驗依據(jù)。
　　研究方法:第一批次動物實驗使用體重為30±2g清潔級昆明小鼠56只，雌28只雄28只，實驗動物由中國醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，實驗動物合格證號:SYXK（遼）200

5、8-0005。動物實驗室溫度控制在18～23℃，相對濕度保持為45％～55％，普通光照，動物自由飲水、攝食，動物飼料由實驗動物中心提供。正式實驗前適應(yīng)性喂飼7天，按照體重隨機(jī)分成4組，每組14只，雌7雄7只。分組情況如下:第1組為空白對照組（0.9％氯化鈉），第2組為低劑量單純?nèi)惧i組(12.5mg/kg MnCl2)、第3組為中劑量單純?nèi)惧i組(25.0mg/kg MnCl2)、第4組為高劑量單純?nèi)惧i組（50.0mg/kg MnCl2）。

6、注射容積為5ml/kg，對照組腹腔注射0.9％氯化鈉，低、中、高劑量染錳組分別腹腔注射12.5、25.0、50.0mg/kg MnCl2。染毒1次/天，持續(xù)14天。在實驗的過程中采取痛苦最少的方法處置動物。在最后1次處理完24小時后，用水合氯醛將小鼠麻醉，心臟放血處死小鼠，冰浴下分離腦組織，切取紋狀體。觀察小鼠的體重變化，觀察不同染錳組小鼠自主活動分析、Morris水迷宮實驗及避暗實驗，伊紅蘇木素染色和透射電鏡觀察紋狀體的組織形態(tài)改變，

7、試劑盒檢測GSH含量，免疫組化法檢測EAAC1和xCT的陽性表達(dá)，Western blotting法檢測紋狀體內(nèi)EAAC1和xCT蛋白水平的變化。第二批次動物實驗使用體重為30±2g清潔級昆明小鼠112只，雌56雄56只，實驗動物由中國醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，實驗動物合格證號:SYXK(遼)2008-0005。動物實驗室溫度17-23℃，相對濕度45％～55％，普通光照，動物自由飲水、攝食，動物飼料由實驗動物中心提供。正式實驗前適應(yīng)性

8、喂飼7天，按體重隨機(jī)分成8組，每組14只，雌7雄7只。分組情況如下:第1組為空白對照組（0.9％的0.9％氯化鈉）、第2組為單純?nèi)惧i組（50.0mg/kg MnCl2）、第3組為低劑量萊菔硫烷染錳組（1.5mg/kg SFN+50.0mg/kg MnCl2）、第4組為中劑量萊菔硫烷染錳組（3.0mg/kg SFN+50.0mg/kg MnCl2）、第5組為高劑量萊菔硫烷染錳組（6.0mg/kg SFN+50.0mg/kg MnCl2）、

9、第6組為低劑量異煙肼染錳組（60.0mg/kg INH+50.0mg/kg MnCl2）、第7組為中劑量異煙肼染錳組(90.0mg/kgINH+50.0mg/kg MnCl2)、第8組為高劑量異煙肼染錳組（120.0mg/kg INH+50.0mg/kg MnCl2）。染毒方式為腹腔注射，干預(yù)方式皮下注射，先干預(yù)，2h后染毒，注射容量均為5ml/kg。第1、2組皮下注射0.9％的0.9％氯化鈉，第3、4、5組分別皮下注射1.5、3.0和

10、6.0 mg/kg SFN，第6、7、8組分別皮下注射60.0、90.0和120.0mg/kg INH，2h后，第1組注射0.9％氯化鈉，第2～8組注射50mg/kg MnCL2。每天染毒一次，隔日干預(yù)一次，持續(xù)14天。在實驗的過程中采取痛苦最少的方法處置動物。在最后1次處理完24小時后，用水合氯醛將小鼠麻醉，心臟放血處死小鼠，冰浴下分離腦組織，切取紋狀體。觀察小鼠的體重變化，試劑盒檢測GSH含量，免疫熒光染色檢測GSH含量，免疫熒光雙

11、染法檢測Nrf2與EAAC1和Nrf2與xCT的表達(dá)，Western blotting法檢測紋狀體內(nèi)Nrf2、EAAC1和xCT蛋白水平的變化。
　　結(jié)果:1、錳對小鼠紋狀體GSH合成的影響。小鼠的體重測定:各實驗組小鼠分別與空白對照組比較，體重在同一時間段均無顯著性差異(P＞0.05); ZZ-6小鼠自主活動測試儀檢測小鼠自主活動次數(shù)和站立次數(shù):與空白對照組相比，在高劑量染錳組中小鼠活動次數(shù)顯著下降(P＜0.01)，在中、高劑量

12、染錳組小鼠站立次數(shù)下降(P＜0.05，P＜0.01)。伊紅蘇木素和透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn):與空白對照組相比，中、高劑量染錳組小鼠腦紋狀體的組織形態(tài)損傷逐漸加劇，細(xì)胞出現(xiàn)損傷，細(xì)胞數(shù)目逐漸減少;各組小鼠GSH含量的測定:與空白對照組相比，在中、高劑量染錳組顯著減少(P＜0.01，P＜0.01);免疫組化檢測小鼠腦紋狀體EAAC1和xCT的表達(dá):與空白對照組相比，高劑量染錳組EAAC1的陽性面積比和積分光密度表達(dá)下降最為顯著(P＜0.01，P＜0

13、.01)，xCT在高劑量染錳組陽性面積比和積分光密度表達(dá)下降最為顯著(P＜0.01，P＜0.01);小鼠腦紋狀體內(nèi)EAAC1和xCT蛋白水平表達(dá):EAAC1和xCT在中、高劑量染錳組蛋白水平顯著下降(P＜0.05，P＜0.01)。2、Nrf2信號通路調(diào)控EAAC1和xCT在錳致小鼠紋狀體GSH合成異常中的作用。小鼠的體重測定:各實驗組小鼠分別與空白對照組和染錳組相比較，體重在同一時間段均無顯著性差異（P＞0.05）;試劑盒檢測GSH含量

14、:與空白對照組比較，高劑量染錳組小鼠GSH含量顯著降低(P＜0.01)，與高劑量染錳組相比，給予萊菔硫烷干預(yù)后，隨著干預(yù)劑量的增加，GSH含量逐漸升高，其中第5組即高劑量萊菔硫烷染錳組GSH含量升高最為顯著(P＜0.01)，給予異煙肼干預(yù)后，隨著干預(yù)劑量的增加，GSH含量逐漸下降，第8組為高劑量異煙肼染錳組GSH含量下降最為顯著(P＜0.01);免疫熒光染色檢測GSH含量:與空白對照組比較，高劑量染錳組小鼠GSH表達(dá)明顯降低，與高劑量染

15、錳組相比，給予萊菔硫烷干預(yù)后，隨著干預(yù)劑量的增加，GSH表達(dá)逐漸增多，第5組即高劑量萊菔硫烷染錳組GSH含量升高最為明顯，給予異煙肼干預(yù)后，隨著干預(yù)劑量的增加，GSH表達(dá)逐漸減少，第8組即高劑量異煙肼染錳組GSH含量明顯降低;免疫熒光雙染法檢測Nrf2與EAAC1和Nrf2與xCT的表達(dá):與空白對照組比較，高劑量染錳組小鼠腦紋狀體Nrf2與EAAC1和Nrf2與xCT表達(dá)均下降;與高劑量染錳組相比，給予萊菔硫烷干預(yù)后，隨著干預(yù)劑量的增加

16、，Nrf2與EAAC1和Nrf2與xCT表達(dá)逐漸增多，第5組最為明顯，給予異煙肼干預(yù)后，隨著干預(yù)劑量的增加，Nrf2與EAAC1和Nrf2與xCT表達(dá)逐漸減少，第8組最為明顯;小鼠腦紋狀體內(nèi)Nrf2、EAAC1和xCT蛋白表達(dá):與空白對照組比較，高劑量染錳組小鼠Nrf2、EAAC1和xCT蛋白表達(dá)均顯著降低，與高劑量染錳組相比，給予萊菔硫烷干預(yù)后，隨著干預(yù)劑量的增加，Nrf2、EAAC1和xCT蛋白表達(dá)逐漸升高，第5組最為顯著(P＜0.