小鼠NAFLD模型建立及Nrf2缺失對肝臟中CYP2A5表達的影響.pdf

1、隨著人們生活方式和飲食結(jié)構(gòu)的改變，脂肪和糖類的過多攝入，非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)的發(fā)病率呈逐年增高趨勢。NAFLD主要包括，單純脂肪變性、非酒精性脂肪肝炎和肝硬化。某些病例還與肝臟腫瘤有關(guān)。“二次打擊”學說被認為是其主要發(fā)病機制，但仍不十分清楚，目前有效的治療藥物也較少。
　　 核因子相關(guān)因子-2(NF-E2-related Factor2，Nrf2)，

2、幾乎存在各種細胞中，其作用引起了國內(nèi)外廣泛的研究。許多文獻表明其在肝臟的相關(guān)疾病中，起著重要的作用。Nrf2可以通過調(diào)控細胞內(nèi)抗氧化酶和Ⅱ相解毒酶來抵抗氧化應激、減輕肝臟炎癥、對抗肝細胞凋亡等。作為生物體主要的Ⅰ相代謝酶，CYP2A5是肝微粒體混合功能氧化酶系中最重要的一種，不僅與藥物的生物轉(zhuǎn)化等代謝環(huán)節(jié)密切相關(guān)，也和某些疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。研究表明，直接或間接由各種毒性化學物質(zhì)或疾病引起的肝損傷，在炎癥或肝硬化區(qū)域相鄰的肝細胞CYP2

3、A5是呈現(xiàn)增量表達。鎘誘導氧化應激中，野生型小鼠肝細胞CYP2A5表達升高，而Nrf2敲除小鼠肝細胞CYP2A5表達沒有變化。本實驗前期研究結(jié)果已經(jīng)證明，非酒精性脂肪肝模型鼠肝臟CYP2A5的表達量顯著升高。但研究其兩者在非酒精性脂肪肝發(fā)病過程中的變化及其相互影響，鮮有報道。
　　 為了探索非酒精性脂肪肝誘導的CYP2A5增量表達與Nrf2的相關(guān)性，本試驗以野生型和敲除Nrf2的ICR小鼠為實驗動物，根據(jù)前期建立的非酒精性脂肪肝

4、模型的方法，采用高脂飼料配方建立小鼠非酒精性脂肪肝模型，采用免疫組化法研究非酒精性脂肪肝模型鼠肝細胞中Nrf2與CYP2A5的表達關(guān)系以及敲除Nrf2基因?qū)Ψ蔷凭灾靖尾l件下CYP2A5表達的調(diào)控作用。將實驗動物隨機分為野生型高脂組(WT-H FD)、野生型對照組(WT-ND)、Nrf2敲除高脂組(KO-HFD)和Nrf2敲除對照組(KO-ND)，分別飼喂高脂飼料或普通標準飼料。分別在4、6、8周剖殺部分小鼠，根據(jù)小鼠的血清生化指標

5、、肝指數(shù)、肝臟病理組織學變化等指標評價模型鼠隨疾病進程的發(fā)展而發(fā)生的變化。比較KO-HFD小鼠與WT-HFD小鼠疾病進程，分析Nrf2對疾病的影響。采用免疫組化方法分析野生型小鼠和Nrf2基因敲除鼠肝臟中CYP2A5的表達量隨疾病進程發(fā)展發(fā)生變化以及Nrf2對CYP2A5表達的影響。
　　 研究結(jié)果表明:
　　 (1)采用高脂飼料連續(xù)飼喂8周，小鼠血清生化指標和脂質(zhì)發(fā)生明顯的改變。其中血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶

6、(AST)、谷酰轉(zhuǎn)肽酶(GGT)、總膽固醇(T-Chol)、低密度脂蛋白(LDL)和葡糖糖(GLU)均呈升高趨勢;但甘油三酯(TG)為降低趨勢。WT-HFD和KO-HFD小鼠血清中ALT、AST與T-Chol，與各自對照組相比，極顯著升高。在4、6、8周時，KO-HFD小鼠的血清中ALT、AST、T-Chol及GLU含量要顯著高于WT-HFD小鼠?？梢奛rf2對NAFLD疾病發(fā)展有明顯影響。KO-HFD小鼠ALT和T-Chol含量,8周

7、顯著高于4周，總體呈升高趨勢。WT-HFD小鼠T-Chol含量，8周時顯著高于4、6周。
　　 (2)病理組織學結(jié)果顯示，4-8周時與各自對照組相比，KO-HFD小鼠和WT-HFD小鼠肝組織出現(xiàn)顯著的脂肪變性，以中央靜脈周圍為主，多為大、小泡混合型脂肪變性，可見炎性細胞浸潤。在6-8周時KO-HFD小鼠脂肪變性和炎病活動顯著高于WT-HFD小鼠。8周時，相比WT-ND小鼠，KO-ND小鼠肝臟中有脂肪顆粒，但不顯著。提示Nrf2與

8、非酒精性脂肪肝的發(fā)病機制有關(guān)系，Nrf2可能保護肝臟降低NAFLD中脂肪變性程度;敲除Nrf2會影響小鼠脂質(zhì)代謝。8周的WT-HFD小鼠肝臟脂肪變性程度極顯著大于4、6周 WT-H FD小鼠，而4與6周WT-HFD鼠的脂肪變性程度差異不顯著;4-8周各組KO-HFD小鼠的肝臟脂肪變性程度差異極顯著。4-8周時，WT-HFD各組肝臟炎癥活動度差異顯著;KO-HFD小鼠肝臟炎癥活動度8周時顯著高于6周，且8、6周極顯著高于4周。
　　

9、 (3)相比WT-ND小鼠，WT-HFD小鼠肝臟中Nrf2和CYP2A5表達量極顯著升高。4-8周，WT-HFD各組小鼠肝臟中Nrf2表達量呈極顯著的升高;4-8周，WT-HFD各組小鼠肝臟中CYP2A5表達呈顯著上升，Nrf2與CYP2A5的表達呈正相關(guān)性。
　　 (4)4-8周時，KO-ND小鼠肝臟中CYP2A5的表達低于WT-ND小鼠，但差異不顯著;4-8周時，KO-HFD小鼠肝臟中CYP2A5的表達量極顯著低于WT-H

10、FD小鼠。在Nrf2敲除小鼠中沒有檢測到NrF2的陽性表達。提示抑制Nrf2表達，CYP2A5的表達量降低，Nrf2F非酒精性脂肪肝中調(diào)控CYP2A5的表達;相比于KO-ND，KO-HFD小鼠中CYP2A5表達量略有升高，但不顯著，提示CYP2A5的調(diào)控還可能涉及除Nrf2以外的其他轉(zhuǎn)錄或調(diào)節(jié)因子。
　　 本試驗在成功建立小鼠NAFLD模型的基礎上，旨在檢測各組小鼠肝臟組織中Nrf2和CYP2A5的表達情況，研究NAFLD模型小