Nrf2重組慢病毒對細(xì)胞增殖、凋亡和分化的影響及小鼠ACLT骨關(guān)節(jié)炎模型的建立與鑒定.pdf

1、目的：構(gòu)建轉(zhuǎn)錄因子NF-E2相關(guān)因子（NF-E2 related factor, Nrf2）重組慢病毒（lentivirus），靶向Nrf2和ATF4（activating transcription factor4）的siRNA重組慢病毒顆粒；探究Nrf2基因的重組慢病毒修飾對細(xì)胞向成骨細(xì)胞及軟骨骨細(xì)胞分化過程中增殖、凋亡和分化的影響；建立小鼠膝蓋前交叉韌帶切除術(shù)（ anterior cruciate ligament transec

2、tion, ACLT）的骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病模型。
　　方法：將載有目的基因Nrf2序列的慢病毒骨架質(zhì)粒pWPT-GFP-Nrf2與pMD2G、pSPAX2慢病毒包裝質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染于293T細(xì)胞中，完成Nrf2慢病毒的包裝，同理設(shè)計并完成Lv-siNrf2和Lv-ATF4慢病毒的構(gòu)建與包裝；在BMP2誘導(dǎo)C2C12細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的過程中，設(shè)立不同的病毒處理組，檢測Nrf2及ATF4對C2C12細(xì)胞增殖、凋亡及分化的影響；高密度微團培養(yǎng)C

3、3H10細(xì)胞，并在BMP2處理下誘導(dǎo)其向軟骨細(xì)胞分化，檢測Lv-Nrf2對C3H10向軟骨細(xì)胞分化過程中增殖和凋亡的影響，胎鼠腿骨組織體外培養(yǎng)，設(shè)立不同病毒處理組，腿組織包埋切片后，Tunel染色檢測胎鼠軟骨組織的凋亡情況，免疫組織化學(xué)法檢測凋亡相關(guān)蛋白在軟骨組織中的表達(dá)與分布；手術(shù)建立小鼠ACLT骨關(guān)節(jié)炎模型并對其進行評估鑒定。
　　結(jié)果：成功包裝了重組慢病毒Lv-Nrf2、Lv-siNrf2及Lv-siATF4（滴度約為1×1

4、08efu/mL）；BMP2誘導(dǎo)C2C12細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化過程中，F(xiàn)CM的結(jié)果顯示，BMP2+Lv-Nrf2組細(xì)胞凋亡率低于BMP2+Lv-GFP組，BMP2+Lv-siNrf2組細(xì)胞凋亡率高于BMP2+Lv-GFP組， BMP2+Lv-Nrf2+Lv-siATF4組細(xì)胞凋亡率低于BMP2+Lv-GFP組并同時低于BMP2+ Lv-siATF4組；western結(jié)果與FCM凋亡結(jié)果一致；免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示，實驗組BMP2+Lv-Nr

5、f2組中骨鈣蛋白(Osteocalcin, OCN)與堿性磷酸酶(Alkaline Phosphatase, ALP)表達(dá)增高，而BMP2+Lv-siNrf2組中兩種蛋白表達(dá)均降低，聯(lián)合處理組BMP2+Lv-Nrf2+Lv-siATF4中兩種蛋白表達(dá)低于對照組和BMP2+Lv-Nrf2組；在BMP2誘導(dǎo)微團培養(yǎng)的C3H10細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化過程中，F(xiàn)CM的結(jié)果顯示，與空病毒處理組相比，Lv-Nrf2組C3H10凋亡率下降，細(xì)胞中占S期的

6、細(xì)胞比例上升；western結(jié)果與FCM結(jié)果一致；Tunel細(xì)胞熒光染色結(jié)果顯示，與空病毒處理組相比，Lv-Nrf2處理組細(xì)胞凋亡率顯著下降；Tunel熒光及組織化學(xué)染色對胎鼠腿骨石蠟切片進行染色，結(jié)果顯示，與Lv-GFP處理組相比，Lv-Nrf2可以減少胎鼠腿骨組織中軟骨細(xì)胞凋亡的發(fā)生；成功在野生型小鼠和 PGRN缺陷型小鼠中建立ACLT骨關(guān)節(jié)炎模型；PGRN缺陷型小鼠比野生型小鼠 ACLT手術(shù)后，骨關(guān)節(jié)炎的癥狀更加嚴(yán)重。
　　

7、結(jié)論：一方面，在 BMP2誘導(dǎo) C2C12細(xì)胞成骨分化過程中，Nrf2基因可抑制C2C12細(xì)胞的凋亡，促進其向成骨分化，同時，可挽回因ATF4蛋白減少而產(chǎn)生的細(xì)胞凋亡；另一方面，在 BMP2誘導(dǎo)微團培養(yǎng)的 C3H10細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化過程中，Nrf2可抑制C3H10細(xì)胞的凋亡并促進細(xì)胞的增殖，對軟骨組織的細(xì)胞具有一定保護作用；小鼠 ACLT模型在構(gòu)建后8周時，關(guān)節(jié)炎的癥狀最為明顯，PGRN基因可能參與關(guān)節(jié)軟骨的損傷修復(fù)，可能參與骨關(guān)節(jié)炎