轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子CodY在蘇云金牙胞桿菌中的作用研究.pdf

1、蘇云金芽胞桿菌是一種能產(chǎn)生芽胞的土壤細(xì)菌，它在穩(wěn)定期形成芽胞以及大量的伴胞晶體形式的殺蟲(chóng)晶體蛋白。晶體蛋白代謝調(diào)控機(jī)制是蘇云金芽胞桿菌研究的熱點(diǎn)之一，目前芽胞形成機(jī)制的研究已有了突破性的進(jìn)展，但是關(guān)于晶體蛋白代謝調(diào)控的機(jī)制仍然沒(méi)有一個(gè)合理并清晰的解釋。CodY是革蘭氏陽(yáng)性菌中的全局性轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，可調(diào)控200多個(gè)基因的表達(dá)，它們多數(shù)是穩(wěn)定期表達(dá)的基因，也包括許多病原微生物的毒力基因。目前關(guān)于CodY在蘇云金芽胞桿菌中功能的研究報(bào)道很少，

2、本研究主要通過(guò)構(gòu)建過(guò)表達(dá)CodY蛋白的蘇云金芽胞桿菌工程菌和敲除cody基因的突變株來(lái)分析該蛋白在蘇云金芽胞桿菌中的作用機(jī)制，試圖尋找CodY蛋白與伴胞晶體蛋白形成以及其它代謝調(diào)控的相關(guān)性，從而為構(gòu)建整個(gè)蘇云金芽胞桿菌的代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)奠定基礎(chǔ)。
　　 1．根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室已公布的蘇云金芽胞桿菌BMB171和CT-43以及未完全公布的YBT-1520的全基因組序列，我們對(duì)CodY蛋白進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，結(jié)果表明它與臘狀芽胞桿菌屬的核苷

3、酸相似性在99％以上，但是與枯草芽胞桿菌比較，差異比較大，并且在染色體中cody基因上下游的基因與枯草芽胞桿菌相比差異也十分明顯。
　　 2．本實(shí)驗(yàn)利用一個(gè)過(guò)表達(dá)載體pHT1K-Plip-TS，構(gòu)建了過(guò)表達(dá)CodY蛋白的重組載體pHT1K-PlipcodyTS。將重組載體電轉(zhuǎn)化蘇云金芽胞桿菌野生株YBT-881中，得到重組菌株YBT-881-L1。對(duì)其特性鑒定后表明：YBT-881-L1和野生株的生長(zhǎng)曲線以及伴胞晶體形態(tài)沒(méi)有明顯

4、差異，然而通過(guò)SDS-PAGE、質(zhì)譜分析以及RT-PCR發(fā)現(xiàn)：工程菌與野生株相比，兩株菌株都含有相同的Cry1類(lèi)蛋白，而在工程菌株中沉默的cry2Ac基因被激活表達(dá)，并產(chǎn)生大量的Cry2Ac蛋白，序列比對(duì)后證實(shí)該cry2Ac基因與cry2Ac4相似率為99%以上，這樣使得在工程菌中同時(shí)含有Cry2A類(lèi)與Cry1類(lèi)兩種晶體蛋白。至于刺激誘導(dǎo)Cry2Ac蛋白表達(dá)的原因還需進(jìn)一步研究。
　　 3．本實(shí)驗(yàn)利用一個(gè)溫敏性載體構(gòu)建了基因敲除

5、載體pBMB0413，然后通過(guò)同源重組方法在蘇云金芽胞桿菌BMB171中構(gòu)建了cody基因的缺失突變株。通過(guò)PCR擴(kuò)增、Western blot分析以及RT-PCR驗(yàn)證該突變株中CodY蛋白不能轉(zhuǎn)錄表達(dá)。對(duì)此突變株的特性進(jìn)行鑒定后表明：突變株不能正常形成完整的芽胞。并且突變株中PHB含量在12h達(dá)到最高值后，在穩(wěn)定期內(nèi)不被降解而是維持在一個(gè)穩(wěn)定的水平，而在BMB171中PHB含量在8h至10h時(shí)達(dá)到最高值后急劇下降，分析原因：PHB是碳