Wnt-β-catenin信號(hào)通路在松質(zhì)骨和皮質(zhì)骨的差異性表達(dá)及對(duì)骨量的影響.pdf

1、背景與目的:
　　脊柱動(dòng)物的骨骼包含了松質(zhì)骨和皮質(zhì)骨。松質(zhì)骨多存在于短骨和扁平骨以及長(zhǎng)骨的干骺端。皮質(zhì)骨多存在于長(zhǎng)骨骨干、短骨和扁平骨的皮質(zhì)。松質(zhì)骨和皮質(zhì)骨結(jié)構(gòu)不同，機(jī)械特性和代謝特性也不盡相同。結(jié)構(gòu)上，皮質(zhì)骨堅(jiān)硬致密，其骨單位和叢狀薄片在長(zhǎng)骨縱向排列;松質(zhì)骨則相對(duì)疏松，由各個(gè)不同方向的骨小梁構(gòu)成。另外，松質(zhì)骨表面積較大，血供較豐富。結(jié)構(gòu)的不同導(dǎo)致二者機(jī)械特性的差異。相對(duì)于松質(zhì)骨，皮質(zhì)骨有更高的彈性模量和更高的礦化水平，因而更加堅(jiān)

2、硬但同時(shí)脆性也更高。
　　另外，松質(zhì)骨和皮質(zhì)骨在許多生理和病理情況存在代謝差異，如糖基化、藥物代謝、對(duì)飲食以及內(nèi)固定物的植入的反應(yīng)。這種代謝的不同尤其表現(xiàn)在與骨質(zhì)疏松治療密切相關(guān)的骨重塑過(guò)程。松質(zhì)骨較薄，低骨量且表面積大，基質(zhì)內(nèi)的信號(hào)容易到達(dá)骨表面啟動(dòng)骨重塑。相對(duì)的，皮質(zhì)骨骨量較多、骨表面少，因此，基質(zhì)深部的信號(hào)可能較難到達(dá)骨表面啟動(dòng)骨重塑。
　　此外，在機(jī)械負(fù)荷下，松質(zhì)骨和皮質(zhì)骨骨吸收水平差異，導(dǎo)致了骨形成能力的不同。松質(zhì)

3、骨和皮質(zhì)骨骨代謝的差異可能是抗骨質(zhì)疏松藥物對(duì)非椎體骨折療效欠佳的原因。造成皮質(zhì)骨和松質(zhì)骨之間各種差異的原因還尚未完全明了。一般認(rèn)為器官或組織的功能取決于細(xì)胞功能，并被多種激素和因子通過(guò)信號(hào)通路調(diào)控。尤其是骨骼，各種調(diào)節(jié)因子最終通過(guò)相同的細(xì)胞和信號(hào)通路，導(dǎo)致了松質(zhì)骨和皮質(zhì)骨在成分、結(jié)構(gòu)和代謝特性的差異。很多證據(jù)表明Wnt/β-catenin信號(hào)通路在骨發(fā)育、骨形成和骨重塑起了核心作用。因此假設(shè)長(zhǎng)骨中皮質(zhì)骨和松質(zhì)骨表現(xiàn)出不同的骨代謝水平可能

4、是由于wnt通路中相關(guān)因子的表達(dá)水平存在差異而造成的。
　　為此開展了以下實(shí)驗(yàn):1、收集野生型小鼠脛骨干骺端的松質(zhì)骨和骨干的皮質(zhì)骨，分別檢測(cè)Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)因子的轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)表達(dá)水平。2、采用持續(xù)激活和敲除β-catenin的小鼠模型，檢測(cè)骨代謝過(guò)程中成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的相關(guān)指標(biāo)在松質(zhì)骨和皮質(zhì)骨中的表達(dá)情況。
　　方法:
　　第一部分:收集野生型小鼠脛骨的干骺端的松質(zhì)骨和骨干的皮質(zhì)骨，分別檢測(cè)了W

5、nt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)因子表達(dá)的差異。
　　1.利用實(shí)時(shí)定量PCR(Polymerase chain reaction)，檢測(cè)松質(zhì)骨和皮質(zhì)骨的Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)因子Wnt3a、Wnt4、Wnt5a、Wnt7、Wnt10a、Wnt16、LRP5(Low-density lipoprotein receptor-related protein5)、LRP6、LRP4;β-連環(huán)蛋白(β-catenin)

6、、T細(xì)胞因子(T cell factor,TCF)。以及淋巴增強(qiáng)子因子(lymphoid enhancer-binding factor1，LEF-1);axin-2、細(xì)胞周期蛋白D1(cyclin D1)。Wnt1誘導(dǎo)分泌蛋白(WNT1inducible signaling pathway protein1，WISP-1)、原癌基因(c-Myc)、骨鈣蛋白(Osteocalcin，OCN)、堿性磷酸酶(Alkaline pho sph

7、atase，ALP);核因子-κB受體活化因子配體(Receptor activator of nuclear factor-kb ligand，RANKL)、骨保護(hù)蛋白(Osteoprotegerin，OPG)的表達(dá)水平。
　　2.利用免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)因子β-catenin、成骨細(xì)胞標(biāo)志物核心結(jié)合因子(Runt-related transcription factor2，Runx2)、成

8、骨相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子抗體(Osterix，OSX)、RANKL的蛋白表達(dá)水平。
　　3.TRAP染色觀察成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞數(shù)量。
　　4.小鼠長(zhǎng)骨原代成骨細(xì)胞及骨細(xì)胞體外分離培養(yǎng)，細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)因子β-catenin、Runx2，檢測(cè)成骨細(xì)胞標(biāo)記物OSX，破骨細(xì)胞標(biāo)記物RANKL。
　　5.小鼠長(zhǎng)骨原代成骨細(xì)胞及骨細(xì)胞體外分離培養(yǎng)，分別提取核蛋白和漿蛋白，Western bloting

9、比較β-catenin的入核比。
　　6.分別提取長(zhǎng)骨干骺端及骨干蛋白，Western bloting比較LRP6、β-catenin、ALP、Runx2、cyclinD1、OCN的蛋白表達(dá)水平。
　　第二部分:采用激活和敲除β-catenin的小鼠模型，觀察Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)因子在松質(zhì)骨和皮質(zhì)骨中的表達(dá)情況，及骨代謝水平的變化。
　　1.利用實(shí)時(shí)定量PCR，檢測(cè)松質(zhì)骨和皮質(zhì)骨的Wnt/β-cate

10、nin信號(hào)通路相關(guān)因子TCF、LEF-1;WISP-1、axin-2、cyclin D1、c-Myc、OCN、ALP、RANKL、OPG;
　　2.Western bloting檢測(cè)Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)因子β-catenin、ALP、Runx2、cyclinD1的蛋白表達(dá)水平。
　　3.抗酒石酸酸性磷酸酶染色觀察破骨細(xì)胞數(shù)量及功能。
　　4.Micro CT掃描觀察小鼠干骺端和骨干的骨量、骨密度情況。

11、
　　結(jié)果:
　　一、Wnt/β-catenin信號(hào)通路及骨代謝的相關(guān)因子在小鼠脛骨的松質(zhì)骨和皮質(zhì)骨表達(dá)具有明顯的差異性。
　　1.實(shí)時(shí)定量PCR顯示:Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)因子Wnt3a、Wnt5a、β-catenin、TCF、LEF-1、WISP、axin-2、cyclin D1、c-Myc、RANKL以及成骨細(xì)胞標(biāo)志物ALP、OCN在松質(zhì)骨的表達(dá)水平高于皮質(zhì)骨。
　　2.骨吸收方面，松質(zhì)骨的

12、RANKL/OPG比值高于皮質(zhì)骨，TRAP染色顯示，單位面積的松質(zhì)骨的成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞數(shù)量高于皮質(zhì)骨。
　　3.Western bloting顯示松質(zhì)骨成骨細(xì)胞的β-catenin入核比高于皮質(zhì)骨，松質(zhì)骨的LRP6、β-catenin、ALP、Runx2、cyclin D1、OCN的表達(dá)水平高于皮質(zhì)骨。
　　4、免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)結(jié)果、細(xì)胞熒光結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了上述結(jié)果。
　　二、持續(xù)激活β-catenin后，對(duì)松質(zhì)

13、骨和皮質(zhì)骨的骨代謝影響明顯不同。
　　1、在成骨細(xì)胞持續(xù)激活β-catenin后，β-catenin、TCF、LEF-1、WISP、axin-2、cyclin D1、c-Myc、ALP and OCN的mRNA(m-Ribonucleic acid，核糖核酸)水平上升，但松質(zhì)骨的變化幅度大于皮質(zhì)骨。
　　2、松質(zhì)骨的成骨細(xì)胞增加以及破骨細(xì)胞數(shù)量的下降比皮質(zhì)骨明顯。
　　3、松質(zhì)骨骨量和骨密度增加的幅度比皮質(zhì)骨大。

14、>　　三、敲除β-catenin后，松質(zhì)骨的反應(yīng)和骨代謝水平的下降均比皮質(zhì)骨明顯。
　　1、持續(xù)敲除β-catenin后，除了RANKL/OPG比值上升外，TCF、LEF-1;WISP-1、axin-2、cyclin D1、c-Myc、OCN、ALP、RANKL、OPG的RNA表達(dá)水平下降，但松質(zhì)骨的變化幅度大于皮質(zhì)骨。
　　2、松質(zhì)骨的成骨細(xì)胞減少及破骨細(xì)胞數(shù)量的上升比皮質(zhì)骨明顯。
　　3、松質(zhì)骨骨量下降的幅度比皮質(zhì)