RANKL蛋白的制備及其與RANK蛋白親和力的分析.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、本實驗主要通過對TNF家族成員RANKL與其受體RANK在分子水平及細(xì)胞水平親和力不同的分析,來說明RANKL與細(xì)胞結(jié)合的親和力更具有生理水平上的意義。其中RANKL是TNF家族成員,RANK是其受體。兩者通過相互作用,在骨重建、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨轉(zhuǎn)移、乳腺發(fā)生過程中起重要作用。
　　 首先通過基因工程技術(shù)將小鼠的RANKL、RANK基因克隆到原核表達(dá)載體上,再轉(zhuǎn)化到大腸桿菌E.coli中,誘導(dǎo)使其表達(dá)目的蛋白,并通過親和層析,快

2、速蛋白液相層析(FPLC)以及蛋白復(fù)性的方法純化出有活性的目的蛋白,再運(yùn)用FPLC和蛋白交聯(lián)方法觀察RANKL、RANK蛋白在溶液中的多聚狀態(tài),接著通過pull-down實驗和蛋白遷移實驗證明了RANKL、RANK蛋白是相互結(jié)合的,RAW264.7細(xì)胞分化阻斷實驗則證明RNAKL蛋白具有生物功能,最后通過表面等離子共振(SPR)技術(shù)分析RANKL與RANK。蛋白實時結(jié)合過程,測定兩者的親和解離常數(shù)KD為1.09e-10M,再通過ATTA

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