肝癌靶向單鏈抗體的篩選與親和力測定.pdf

1、原發(fā)性肝癌世界上惡性程度極高，且預(yù)后極差的惡性腫瘤之一，其中90％以上為肝細(xì)胞癌(HepatocellularCarcinoma，HCC)，全球每年因HCC而死亡的患者超過100萬。在我國肝癌目前已處于惡性腫瘤死亡率的第二位，每年至少有10萬名新發(fā)現(xiàn)病人，和11萬名肝癌病人死亡。盡管目前肝癌能夠早期發(fā)現(xiàn)，且治療方法有許多種，但治療效果都十分有限，并未顯著延長病人的生存期。大部分肝癌病人對化療及放療等治療均不敏感，能手術(shù)根治的病人僅占15

2、％。近年來，隨著分子生物學(xué)和免疫學(xué)的不斷發(fā)展，對癌基因的認(rèn)識(shí)不斷深入，以及轉(zhuǎn)基因技術(shù)的日趨完善，肝癌基因治療已顯示出一定的前景。成為繼手術(shù)、放療和化療之后第4種治療模式。載體問題一直是肝癌基因治療研究領(lǐng)域的核心技術(shù)之一。肝癌基因治療常用的載體主要分兩大類：病毒載體和非病毒載體。病毒載體存在非導(dǎo)向性、有限的攜帶能力、生產(chǎn)和包裝以及安全性的困擾等問題；近年來，非病毒載體以其安全性，低毒性，低免疫反應(yīng)，靶向性及易于組裝等優(yōu)點(diǎn)被寄予厚望。其中，

3、研究具有肝癌靶向特異性分子是需首要解決的問題， 去唾液酸糖蛋白受體(ASGPR)是肝臟的一種重要且高效的內(nèi)吞受體，主要分布于肝小葉門靜脈周圍肝細(xì)胞的竇面膜微絨毛間隙(MicrovilliClefts)，配體能否在微絨毛間有效滲透可能也是決定ASGPR介導(dǎo)的內(nèi)吞的一個(gè)重要。腎臟的濾過的閾值是60-70kDa，單鏈抗體作為配體不經(jīng)修飾很快從腎臟濾過。Wu等第一次利用ASGP作為配體，將DNA靶向性導(dǎo)入了ASGPR表達(dá)陽性的細(xì)胞(He

4、pG2)細(xì)胞，但由于天然配體分子大、來源困難以及潛在的生物危險(xiǎn)性，目前更傾向于通過生物工程手段獲得靶向分子。至今，已證實(shí)有多種去唾液酸糖蛋白受體的配體可有效介導(dǎo)靶向性DNA轉(zhuǎn)移至肝癌細(xì)胞。如半乳糖基多聚賴氨酸(Lac-PLL)、半乳糖基脂質(zhì)體、半乳糖基聚乙烯亞胺、半乳糖化的膽固醇、醣脂類等。研究表明：scFv可以模擬配體的功能，將目的基因?qū)氲桨屑?xì)胞中，通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用將目的基因?qū)氚屑?xì)胞中。王騫等用抗TfR的單鏈抗體，將HSV-

5、tk基因有效地導(dǎo)入肝癌細(xì)胞HepG2。 噬菌體抗體庫是近年發(fā)展起來的一項(xiàng)分子生物學(xué)新技術(shù)。構(gòu)建容量大、特異性高、穩(wěn)定性高和敏感性強(qiáng)的人源性抗體是此項(xiàng)技術(shù)的核心，也是其遠(yuǎn)大前景的基礎(chǔ)。噬菌體抗體是指在其表面表達(dá)有Fab抗體或單鏈抗體(scFv)的噬菌體。用基因克隆技術(shù)將B細(xì)胞全套可變區(qū)基因克隆出來，組裝到表達(dá)載體內(nèi)并表達(dá)到噬菌體表面形成噬菌體抗體的群體，即為噬菌體抗體庫。經(jīng)特定抗原或細(xì)胞篩選后，便可獲得特異性抗體。 本研究

6、將利用抗體庫技術(shù)，體外篩選、克隆、表達(dá)去唾液酸糖蛋白受體的單鏈抗體，并對單鏈抗體的篩選進(jìn)行了改進(jìn)，進(jìn)一步提高篩選的陽性率，并對所獲得的單鏈抗體進(jìn)行親和力測定，使有利于作為肝癌基因治療的靶向分子，為其作為肝癌的基因治療能在體內(nèi)應(yīng)用成為可能奠定基礎(chǔ)。 [目的] 從人源噬菌體抗體庫(TomlinsonILibrary)中篩選與ASGPR特異性結(jié)合的單鏈抗體。采用捕獲噬菌體ELISA法，從人源抗體庫中篩選抗ASGPR的單鏈抗體，

7、并與間接噬菌體ELISA法相比較。對單鏈抗體的篩選方法進(jìn)行了改進(jìn)，進(jìn)一步提高篩選的陽性率，并對所獲得的單克隆噬菌體進(jìn)行可溶性表達(dá)、純化后進(jìn)行親和力測定，對其抗原結(jié)合性質(zhì)進(jìn)行鑒定。使有利于作為肝癌基因治療的靶向分子，為其作為肝癌的基因靶向能在體內(nèi)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。 [結(jié)論] 在原核表達(dá)系統(tǒng)中成功表達(dá)和純化得到重組去唾液酸糖蛋白受體，該重組去唾液酸糖蛋白受體具有較強(qiáng)的免疫原性；以該重組去唾液酸糖蛋白受體作為抗原篩選Tomlins