當(dāng)歸-紅花配伍協(xié)同增效作用與相關(guān)機制研究.pdf

1、本文分以下幾個章節(jié)進行探討：
　　第一章系統(tǒng)地綜述了中藥配伍相互作用研究方法與進展。
　　第二章 實驗用樣品的制備
　　基于對中醫(yī)方劑數(shù)據(jù)挖掘結(jié)果和統(tǒng)計分析需要，選擇7個不同配比當(dāng)歸-紅花(4∶1、2∶1、3∶2、1∶1、2∶3、1∶2、1∶4)及當(dāng)歸、紅花單味藥，按比例稱取酒當(dāng)歸和紅花，混合，共4.5 kg，以上樣品采用熱回流水提法進行提取，得制各樣品為DG、GH4∶1、GH2∶1、GH3∶2、GH1∶1、GH2∶3

2、、GH1∶2、GH1∶4、HH，冷藏備用。
　　第三章 當(dāng)歸-紅花不同量比養(yǎng)血活血效應(yīng)比較研究
　　第一節(jié) 當(dāng)歸-紅花不同劑量的養(yǎng)血補血作用的比較研究
　　觀察當(dāng)歸、紅花兩藥味不同配比對血虛小鼠的補血作用差異，優(yōu)選當(dāng)歸-紅花配伍補血作用的最佳配比。采用乙酰苯肼與環(huán)磷酰胺聯(lián)合造模法復(fù)制小鼠血虛模型?；诙嘀笜?biāo)綜合指數(shù)法，首先以《中醫(yī)方劑大辭典》數(shù)據(jù)庫中出現(xiàn)頻次最高的當(dāng)歸-紅花1∶1配比為代表，優(yōu)選當(dāng)歸、紅花配伍補血作用的

3、最佳濃度;然后采用優(yōu)選的最佳濃度來觀察當(dāng)歸、紅花不同配比的補血作用變化規(guī)律。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在5個不同濃度（分別為當(dāng)歸、紅花臨床等效量的1、2、3、4、5倍）下，當(dāng)歸-紅花劑量為臨床等效量時的總補血效應(yīng)最好;在當(dāng)歸、紅花的9個不同配比（1∶0、4∶1、2∶1、3∶2、1∶1、2∶3、1∶2、1∶4和0∶1）中，以當(dāng)歸-紅花1∶1的總補血效應(yīng)最好。該結(jié)果與中醫(yī)方劑中使用當(dāng)歸、紅花1∶1頻次最高的用藥規(guī)律相一致，為現(xiàn)代臨床更有效應(yīng)用當(dāng)歸與紅花提供

4、了科學(xué)依據(jù)。
　　第二節(jié) 當(dāng)歸-紅花不同劑量的活血化瘀作用比較研究
　　聯(lián)合應(yīng)用冰水浴和皮下注射鹽酸腎上腺素，復(fù)制大鼠血瘀模型，通過測定全血黏度、血漿黏度、全血高切相對指數(shù)、全血低切相對指數(shù)、紅細(xì)胞聚集指數(shù)，觀察當(dāng)歸-紅花配伍對血瘀大鼠血液流變學(xué)的影響;然后采用多指標(biāo)綜合指數(shù)法綜合評價當(dāng)歸-紅花配伍的總活血化瘀效應(yīng)。結(jié)果顯示，與正常組相比，模型組各指標(biāo)均具有顯著性差異;不同濃度的當(dāng)歸-紅花提取液均能較好的改善急性血瘀大鼠的血

5、液流變學(xué)各指標(biāo)。采用多指標(biāo)綜合指數(shù)法綜合評價不同濃度的當(dāng)歸-紅花提取液的總活血化瘀效應(yīng)值大小順序為:GH3＞GH1＞GH4＞GH2＞GH5。以上結(jié)果說明，不同濃度的當(dāng)歸-紅花提取液對血瘀大鼠均有一定的活血化瘀作用，其中以GH3的活血化瘀效果最優(yōu)，及當(dāng)歸、紅花配伍比例為1∶1時，濃度為臨床用藥劑量的3倍量時活血化瘀效果最好。
　　第三節(jié) 當(dāng)歸-紅花不同配比的活血化瘀作用比較研究
　　為了比較評價當(dāng)歸-紅花(GH)不同配比對急性

6、血瘀大鼠血液流變學(xué)和凝血功能的影響，優(yōu)選當(dāng)歸-紅花配伍活血作用的最佳配比。本實驗采用皮下注射鹽酸腎上腺素和冰水游泳共同復(fù)制急性血瘀大鼠模型，通過測定全血黏度、血漿黏度、全血高切相對指數(shù)、全血低切相對指數(shù)、紅細(xì)胞聚集指數(shù)，觀察當(dāng)歸-紅花配伍對血瘀大鼠血液流變學(xué)的影響;通過測定凝血酶原時間(PT)、凝血酶時間(TT)、活化部分凝血活酶時間(APTT)、血漿纖維蛋白原(FIB)含量及血小板最大聚集率(ADP)，觀察當(dāng)歸-紅花配伍對血瘀大鼠凝血

7、功能及血小板聚集的影響。然后采用主成分分析法和多指標(biāo)綜合指數(shù)法綜合評價當(dāng)歸-紅花配伍的總活血化瘀效應(yīng)。結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組各血液流變學(xué)指標(biāo)和凝血功能指標(biāo)均有顯著性差異;與模型組比較，當(dāng)歸-紅花7個不同配比組及單味藥(DG、HH)組均能較好的改善急性血瘀大鼠的血液流變學(xué)各指標(biāo)，對凝血功能多個指標(biāo)也有較好的調(diào)節(jié)作用。主成分分析法和多指標(biāo)綜合指數(shù)法綜合評價得出，當(dāng)歸-紅花配比1∶1和3∶2的活血化瘀作用最好，其中1∶1的活血化瘀作用

8、更優(yōu)于3∶2。以上結(jié)果說明，當(dāng)歸-紅花配伍能明顯改善血瘀大鼠的血液流變學(xué)及凝血功能異常，且當(dāng)歸-紅花活血化瘀作用的最佳配比與臨床中醫(yī)方劑中使用當(dāng)歸、紅花1∶1頻次最高的結(jié)論相一致，為臨床更有效應(yīng)用當(dāng)歸-紅花配伍提供了科學(xué)依據(jù)。
　　第四節(jié) 當(dāng)歸-紅花的抗氧化量效關(guān)系研究
　　采用DPPH、ABTS、OH·自由基清除法及FRAP法，比較當(dāng)歸-紅花不同配比不同劑量組的抗氧化能力。結(jié)果顯示，當(dāng)歸一紅花配比相同劑量不同時，高劑量組(

9、100 mg/mL)對DPPH、ABTS、OH·自由基有較強的清除率，對Fe3+有較強的還原作用，且對DPPH、ABTS自由基的清除率及對Fe3+的還原作用呈一定的量效關(guān)系。
　　第五節(jié) 當(dāng)歸-紅花的抗凝血量效關(guān)系研究
　　本實驗分別研究了當(dāng)歸-紅花(GH)不同配比不同劑量組對ADP誘導(dǎo)的血小板聚集的影響及對TT、PT、APTT的延長作用、對FIB含量的降低作用。結(jié)果表明，與空白組比較，除當(dāng)歸組外，其他各組對ADP誘導(dǎo)的血小

10、板聚集率有顯著降低作用，且呈一定的量效關(guān)系;與空白組比較，各配比高劑量組(0.50 g/mL）對PT均有顯著延長作用，且除了GH1∶2、GH2∶3、GH2∶1組外，其他各組均呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系;與空白組比較，各配伍組對TT的延長作用呈現(xiàn)一定的劑量關(guān)系;實驗各組對新西蘭大耳白兔體外血漿中FIB的含量均有顯著降低作用，且相同配比不同劑量組間呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系。
　　第四章 當(dāng)歸-紅花配伍在血虛/血瘀大鼠體內(nèi)的代謝產(chǎn)物比較研究
　

11、　第一節(jié) 當(dāng)歸-紅花配伍在血虛大鼠體內(nèi)的代謝產(chǎn)物比較研究
　　采用UHPLC-QTOF/MS聯(lián)用技術(shù)，通過能量梯度(MSE)和質(zhì)量虧損過濾(MDF)方法，對灌胃給藥歸紅藥對及其組成藥味提取物后血虛大鼠血漿、尿液和膽汁中阿魏酸、咖啡酸、羥基紅花黃色素A和6-羥基山奈酚3-O-β-D葡萄糖苷4種效應(yīng)成分的代謝轉(zhuǎn)化特征進行分析。共鑒定得到阿魏酸代謝產(chǎn)物9個，血漿中3個，尿液中9個，膽汁中4個;主要為去羰基、還原、甲基化、水合、二次甲基化

12、、甲基化加水合、乙酰化、硫酯化、一分子葡萄糖醛酸結(jié)合代謝產(chǎn)物?？Х人岽x產(chǎn)物9個，血漿中5個，尿液中6個，膽汁中8個;主要為還原、甲基化、水合、二次甲基化、乙?；⒘蝓セ?、甲基化加硫酯化、一分子葡萄糖醛酸結(jié)合、甲基化加一分子葡萄糖醛酸結(jié)合代謝產(chǎn)物。羥基紅花黃色素A代謝產(chǎn)物8個，血漿中3個，尿液中7個，膽汁中3個;主要為甲基化、羥基化、水合、乙酰化、硫酯化、甘氨酸結(jié)合、牛磺酸結(jié)合、一分子葡萄糖醛酸結(jié)合代謝產(chǎn)物。6-羥基山奈酚3-O-β-D

13、葡萄糖苷代謝產(chǎn)物6個，血漿中2個，尿液中5個，膽汁中4個;主要為脫C6H12O5、乙酰化、甲基化、脫C6H12O5加乙?；?、脫C6H12O5加一分子葡萄糖醛酸結(jié)合、脫C6H12O5加兩分子葡萄糖醛酸結(jié)合代謝產(chǎn)物。結(jié)果說明，歸紅藥對及其組成藥味提取物中主要有效成分在血虛大鼠體內(nèi)存在多種Ⅰ相和Ⅱ相代謝產(chǎn)物，為闡明該藥對及其組成藥味在體內(nèi)發(fā)揮療效的功效物質(zhì)基礎(chǔ)提供依據(jù)。
　　第二節(jié) 當(dāng)歸-紅花配伍在血瘀大鼠體內(nèi)的代謝產(chǎn)物比較研究

14、　　采用UHPLC-QTOF/MS聯(lián)用技術(shù)，通過能量梯度(MSE)和質(zhì)量虧損過濾(MDF)方法，對灌胃給藥歸紅藥對及其組成藥味提取物后血瘀大鼠血漿、尿液和膽汁中阿魏酸、綠原酸、羥基紅花黃色素A和對香豆酸4種效應(yīng)成分的代謝轉(zhuǎn)化特征進行分析。
　　第五章 基于代謝組學(xué)的當(dāng)歸-紅花養(yǎng)血活血作用機理研究
　　第一節(jié) 基于代謝組學(xué)的當(dāng)歸-紅花養(yǎng)血補血作用機理研究
　　采用乙酰苯肼和環(huán)磷酰胺復(fù)合法復(fù)制大鼠血虛模型，將大鼠分為模型組

15、、正常組、當(dāng)歸組、紅花組、歸紅組，運用超高效液相色譜-串聯(lián)四極桿飛行時間質(zhì)譜(UPLC-Q-TOF/MS)技術(shù)，對各組大鼠尿液與血漿中內(nèi)源性代謝物進行測定，采用監(jiān)督模式識別方法正交信號校正結(jié)合偏最小二乘法-判別分析(OPLS-DA)對多變量數(shù)據(jù)進行分析，t檢驗方法進行顯著性統(tǒng)計分析。結(jié)果表明，模式識別中模型組大鼠能較好地與其他組分開;進一步從模型組大鼠尿液及血漿代謝圖譜中定性鑒定出犬尿氨酸、苯丙氨酸、煙酸、鞘氨醇、異亮氨酸、酪氨酸和5-

16、羥色胺潛在代謝生物標(biāo)志物，這些內(nèi)源性物質(zhì)在各給藥組大鼠體內(nèi)得到了不同程度的恢復(fù)，通過獨特通路分析，找到了苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成，纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸的生物合成，色氨酸代謝和酪氨酸代謝等多條血虛證代謝通路。以上結(jié)果顯示，歸紅藥對對血虛大鼠的治療作用可能與10個血虛證代謝通路的調(diào)節(jié)有關(guān)，代謝組學(xué)在中藥的療效和機制研究中是一種很有前途的工具。
　　第二節(jié) 基于代謝組學(xué)的當(dāng)歸-紅花活血化瘀作用機理研究
　　聯(lián)合采用冰水