當歸—川芎藥對功效物質(zhì)與配伍作用機理研究.pdf

1、在中醫(yī)臨床遣藥組方過程中，常常兩味中藥一起配伍使用，有些源自經(jīng)方，有些出乎時方，配伍之后具有良好的協(xié)調(diào)作用或較好的制約作用，這種兩藥味長期固定搭配出現(xiàn)即形成“藥對”。近年來，藥對的研究已逐漸深入，其研究重點已逐步從配伍“是否有效”向“為什么有效”以及“如何更有效”過渡。藥對作為中藥學和方劑學的重要橋梁，其研究對發(fā)展中醫(yī)藥配伍理論和創(chuàng)制現(xiàn)代中藥都具有十分重要的理論意義與實踐價值。因此，本論文以當歸-川芎藥對為實踐對象，結(jié)合現(xiàn)代分析技術(shù)和前

2、沿藥學評價手段對其進行多角度、深層次的研究，基于系統(tǒng)生物學創(chuàng)新思維的整體研究與開發(fā)，對其功效物質(zhì)基礎及配伍作用機理進行系統(tǒng)評價。本論文得到國家自然科學基金——“芎歸系列方功效變化的物質(zhì)基礎與相關(guān)機理研究”等項目資助。
　　本論文共分三章，各章節(jié)的主要內(nèi)容及研究結(jié)果如下:
　　一、文獻研究
　　本部分在對藥對相關(guān)文獻進行整理的基礎上，系統(tǒng)綜述了藥對的功效物質(zhì)基礎、配伍效應、及現(xiàn)代研究策略與方法。首先，基于藥對配伍煎煮過程

3、發(fā)生的量變與質(zhì)變、藥對作用于機體或/和機體相關(guān)環(huán)境后的變化等方面分析并總結(jié)了近年來藥對功效物質(zhì)基礎研究的最新進展;其次，從整體動物、組織、器官，與細胞分子等不同層面總結(jié)藥對的配伍效應，以方劑-藥對-單味藥-成分（群）配伍-單體成分為主線，比較評價其協(xié)同增效或配伍減毒作用相關(guān)機制;然后，基于現(xiàn)代科學技術(shù)，總結(jié)歸納并提出藥對的現(xiàn)代研究策略與方法;最后，在此基礎上理出本論文的研究思路，設計合理可行的實驗方案和技術(shù)路線。
　　二、歸芎藥對

4、補血活血整合效應及其與效應成分的關(guān)聯(lián)性分析
　?。ㄒ唬┗赨HPLC-TQ/MS法比較評價歸芎藥對中主要芳香酸類和苯酞內(nèi)酯類成分的含量變化
　　建立超高效液相色譜串聯(lián)三重四級桿質(zhì)譜法(UHPLC-TQ/MS)同時測定歸芎藥對及其組成藥味中3個芳香酸（綠原酸、咖啡酸、阿魏酸）和6個苯酞內(nèi)酯（洋川芎內(nèi)酯I，洋川芎內(nèi)酯H，洋川芎內(nèi)酯A，丁基苯酞，藁本內(nèi)酯、正丁烯基苯酞）成分的含量。采用ACQUITYTM UPLC BEH C18色

5、譜柱，以0.1％甲酸水溶液(A)和乙腈(B)為流動相，梯度洗脫，流速0.4 mL·min-1，柱溫30℃; Waters XevoTM TQ質(zhì)譜儀以多反應離子監(jiān)測（MRM）方式進行離子監(jiān)測。各成分在10 min分離良好，在相應濃度范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均＞0.9948，加樣回收率（n=6）為97.56％～102.24％，RSD范圍為2.07％～4.67％。川芎單味藥中各成分的含量高于當歸單味藥;歸芎藥對中各成分的含量并

6、不等于兩藥味中各成分的加和，說明當歸和川芎在共同煎煮過程中存在成分的相互作用。該方法簡便、快速、重復性好、專屬性強，適用于傘形科植物含有以上9種成分的快速含量分析。
　?。ǘ┍容^評價當歸川芎配對伍用對血虛小鼠的補血作用
　　采用乙酰苯肼和環(huán)磷酰胺聯(lián)合復制血虛小鼠模型。與正常組比較，血虛小鼠外周血常規(guī)中白細胞、紅細胞、血紅蛋白和紅細胞壓積均有顯著性差異，說明模型成功復制。給予當歸、川芎和歸芎藥對不同配比(1∶0、2∶1、1.

7、5∶1、1∶1、1∶1.5、1∶2、0∶1)、不同提取方法（水提模擬水煎、醇提模擬酒制、先水提后醇提模擬散劑應用）所得樣品后，經(jīng)過數(shù)據(jù)的標準化，分別從相同配比不同提取方法和同一提取方法不同配比來比較歸芎藥對的養(yǎng)血補血作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相同配比下，歸芎藥對水提液和先水提后醇提液對血虛小鼠的補血作用優(yōu)于醇提液;相同提取方法下，歸芎藥對1.5∶1配比對血虛小鼠的補血作用較優(yōu)。
　?。ㄈ┍容^評價當歸川芎配伍對急性血瘀大鼠血液流變學及凝血功

8、能的影響
　　采用多指標綜合指數(shù)法，對歸芎藥對1∶1和1.5∶1配比及其組成藥味當歸、川芎的水提物、醇提物和先水提后醇提物對急性血瘀大鼠的活血化瘀效應包括血液流變學和凝血功能活性進行評價。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當歸、川芎單味藥及歸芎藥對1∶1和1.5∶1的水提物、醇提物和先水提后醇提物給藥均能降低血液流變學各指標，對凝血功能指標有顯著改善作用。提取方法相同時，歸芎藥對1∶1醇提物給藥組的總活血效應為最好，且川芎單味藥的總活血效應優(yōu)于當歸;配比

9、相同的情況下，醇提給藥組的總活血效應優(yōu)于水提和先水提后醇提給藥組。說明當歸-川芎配伍能明顯改善血瘀大鼠的血液流變學及凝血功能異常。
　?。ㄋ模┗谌斯ど窠?jīng)網(wǎng)絡的歸芎藥對整體功效與化學物質(zhì)關(guān)聯(lián)性分析
　　采用人工神經(jīng)網(wǎng)絡技術(shù)，將歸芎藥對中的7個主要效應成分（阿魏酸、綠原酸、咖啡酸、洋川芎內(nèi)酯I、洋川芎內(nèi)酯H、藁本內(nèi)酯、和正丁烯基苯酞）及3個芳香酸和4個苯酞內(nèi)酯的總含量與養(yǎng)血補血、活血化瘀和調(diào)經(jīng)止痛的整合效應進行了擬合性相關(guān)分析

10、。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，芳香酸，尤其是綠原酸和咖啡酸對養(yǎng)血補血效應貢獻較大;芳香酸和苯酞內(nèi)酯，尤其是綠原酸、洋川芎內(nèi)酯I和H對活血化瘀貢獻較大;芳香酸和苯酞內(nèi)酯，尤其是藁本內(nèi)酯、咖啡酸、阿魏酸和洋川芎內(nèi)酯I對調(diào)經(jīng)止痛效應貢獻較大。芳香酸更偏重于補血活血，苯酞內(nèi)酯更偏重于活血止痛。初步闡釋方藥不同功效的效應物質(zhì)及其對整體功效的貢獻大小，為方藥復雜效應物質(zhì)基礎研究提供了新的思路與方法。
　　三、基于代謝及其組學和網(wǎng)絡藥理學的歸芎藥對補血活血作用機

11、理研究
　　（一）當歸、川芎和歸芎藥對中主要芳香酸類成分在血虛大鼠體內(nèi)的代謝研究
　　采用UHPLC-QTOF/MS聯(lián)用技術(shù)，通過能量梯度(MSE)和質(zhì)量虧損過濾(MDF)方法，對灌胃給藥歸芎藥對及其組成藥味提取物后血虛大鼠血漿、尿液和膽汁中阿魏酸、綠原酸和咖啡酸3種效應成分的代謝轉(zhuǎn)化特征進行分析。共鑒定得到阿魏酸代謝產(chǎn)物13個，血漿中4個，尿液中9個，膽汁中8個;主要為還原、水解、甲基化、去甲基后羥基化、乙?；⒏拾彼峤Y(jié)合

12、、硫酸酯化、牛磺酸結(jié)合、1分子葡萄糖醛酸結(jié)合、2分子葡萄糖醛酸結(jié)合、硫酸結(jié)合+1分子葡萄糖醛酸結(jié)合、谷胱甘肽結(jié)合和S-谷胱甘肽結(jié)合代謝產(chǎn)物。綠原酸代謝產(chǎn)物6個，血漿中3個，尿液中5個，膽汁中5個;主要為甲基化、酯鍵水解、羥基化、甲基化后結(jié)合半胱氨酸、酯鍵水解后乙?；王ユI水解后葡萄糖醛酸化代謝產(chǎn)物?？Х人岽x產(chǎn)物6個，血漿中4個，尿液中5個，膽汁中3個;主要為甲基化、乙?；⒘蛩狨セ?、甲基化+硫酸酯化、1分子葡萄糖醛酸結(jié)合、和甲基化+1

13、分子葡萄糖醛酸結(jié)合代謝產(chǎn)物。結(jié)果說明，歸芎藥對及其組成藥味提取物中芳香酸類成分在血虛大鼠體內(nèi)存在多種Ⅰ相和Ⅱ相代謝產(chǎn)物，為闡明該藥對及其組成藥味在體內(nèi)發(fā)揮療效的功效物質(zhì)基礎提供依據(jù)。
　　（二）基于代謝組學的歸芎藥對及其組成藥味對血虛大鼠的養(yǎng)血補血作用機制研究
　　基于多學科融匯交叉，采用計算機輔助分析方法，將藥效學和代謝組學進行關(guān)聯(lián)研究。首先，將灌胃給藥歸芎藥對及其組成藥味后對血虛大鼠的養(yǎng)血補血藥效學進行評價，檢測指標主要

14、包括體重、外周血常規(guī)及臟器指數(shù)（脾臟和胸腺）。然后，采用代謝組學策略對血虛大鼠的血漿及尿液內(nèi)源性生物標志物進行分析。在血漿和尿液中分別初步鑒定得到10個和5個潛在的生物標志物，主要為溶血磷脂酰膽堿類、鞘胺醇、油酸、8，11，14-二十碳三烯酸、神經(jīng)酰胺、煙酸、焦磷酸硫胺素、植物鞘胺醇、羥孕烯醇酮和甘油磷酸膽堿。由于鞘氨醇和神經(jīng)酰胺在血漿和尿液中均存在，故在血漿和尿液中共鑒定到13個潛在生物標志物。與正常組比較，血虛組大鼠的溶血性磷脂酰膽

15、堿類、鞘胺醇、煙酸、焦磷酸硫胺素、植物鞘胺醇和甘油磷酸膽堿上調(diào);而油酸、8，11，14-二十碳三烯酸、神經(jīng)酰胺和羥孕烯醇酮下調(diào)。13個生物標志物主要參與的代謝通路有12條，其中以硫胺代謝和鞘脂代謝通路最為主要。將血虛的特征效應指標外周血常規(guī)與內(nèi)源性生物標志物進行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，白細胞、紅細胞、血紅蛋白、紅細胞壓積、單核細胞和中性粒細胞主要與鞘胺醇、植物鞘氨醇、溶血性磷脂酰膽堿類和甘油磷酸膽堿的相對豐度呈較強負相關(guān)，與油酸、8，11，14

16、-二十碳三烯酸和羥孕烯醇酮的相對豐度呈較強正相關(guān);但生物標志物與血小板和淋巴細胞相關(guān)較弱，但相關(guān)均有統(tǒng)計學意義。外周血常規(guī)的藥效學指標結(jié)果和代謝組學結(jié)果均顯示，歸芎藥對及其組成藥味對乙酰苯肼和環(huán)磷酰胺誘導的血虛大鼠有養(yǎng)血補血作用，可調(diào)節(jié)紊亂的代謝通路向正常狀態(tài)轉(zhuǎn)歸;歸芎藥對的養(yǎng)血補血整體作用優(yōu)于其單味藥，且當歸的補血作用較川芎強。
　?。ㄈ┎捎么x組學策略研究歸芎藥對及其組成藥味對血瘀大鼠的活血化瘀作用機制
　　首先，通過

17、血液流變學和凝血功能指標檢測，將歸芎藥對及其組成藥味對急性血瘀大鼠的活血化瘀效應進行評價。然后，采用代謝組學策略，從血瘀大鼠血漿中初步鑒定得到3個潛在生物標志物，溶血性磷脂酰膽堿lysoPC(15∶0)、花生四烯酸和亞油酸。與正常組比較，血瘀大鼠血漿中花生四烯酸和亞油酸上調(diào)，lysoPC(15∶0)下調(diào)。在尿液中初步鑒定得到3個潛在生物標志物，分別為L-苯丙氨酸、L-酪氨酸和L-色氨酸。與正常組比較，血瘀大鼠尿液中L-苯丙氨酸和L-酪氨

18、酸上調(diào)，L-色氨酸下調(diào)。血漿和尿液中標志物主要參與亞油酸代謝、花生四烯酸代謝、苯丙氨酸酪氨酸和色氨酸生物合成、苯丙氨酸代謝、色氨酸代謝和酪氨酸代謝。歸芎藥對及其組成藥味均可調(diào)節(jié)紊亂的生物標志物及其代謝通路，使其向正常狀態(tài)轉(zhuǎn)歸。藥效學和代謝組學結(jié)果均顯示，歸芎藥對的活血化瘀整體作用優(yōu)于其單味藥;川芎單味藥的活血化瘀作用優(yōu)于當歸。通過藥效學指標和內(nèi)源性生物標志物的關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)，血漿中3個標志物主要與全血黏度、全血還原黏度和纖維蛋白原含量呈較

19、強相關(guān);尿液中3個標志物與血液流變學和凝血功能指標整體相關(guān)較弱。研究結(jié)果表明藥效學和代謝組學的結(jié)合在中藥整體性藥效評價、作用機理的闡明等方面具有很好的應用前景。
　?。ㄋ模w芎藥對主要效應成分的網(wǎng)絡藥理學研究
　　采用網(wǎng)絡藥理學方法對歸芎藥對中9個主要入血效應成分（阿魏酸、綠原酸、咖啡酸、藁本內(nèi)酯、洋川芎內(nèi)酯H、洋川芎內(nèi)酯I、洋川芎內(nèi)酯A、丁基苯酞、正丁烯基苯酞）的分子作用機制進行分析，探討其多成分、多靶點、多通路的相關(guān)關(guān)系

20、。依據(jù)PharmMapper數(shù)據(jù)庫構(gòu)建多成分-蛋白網(wǎng)絡;然后采用MAS和KEGG數(shù)據(jù)庫獲得靶蛋白的作用通路;最后，采用Cytoscape軟件建立歸芎藥對成分-靶點-通路網(wǎng)絡模型。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，歸芎藥對中的9個效應成分涉及31個作用蛋白和54條作用通路;54條作用通路涉及神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫-血液系統(tǒng)中的多條;其中，3個芳香酸和6個苯酞內(nèi)酯成分有10條共同作用通路，但兩類成分的其它作用通路又各有側(cè)重。文獻研究和本課題組的代謝組學研究結(jié)果均證實了